益生菌Lactobacillus casei Zhang和Bifidobacterium lactis V9在活性乳酸菌饮料中的应用*

陈世贤，高鹏飞，王记成，孙 婷，张兴昌，司徒文佑，张和平

1(内蒙古伊利实业集团股份有限公司，伊利创新中心，内蒙古呼和浩特，010110)

2(内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，内蒙古呼和浩特，010018)

益生菌是指一类非致病的经过消化系统对人体健康产生积极作用的微生物［1］，它们通过改善人体内的微生态平衡进而促进人体健康。2001年，FAO/WHO(世界粮农组织/世界卫生组织)定义益生菌为“一类活的微生物，足量摄入后对宿主健康有益”［2］。因此，足够的活菌数量和良好的存活稳定性是益生菌用于产品开发及发挥其益生功能的前提。

L.casei Zhang分离自传统发酵酸马奶(koumiss)，具有良好的耐酸性、人工胃肠液耐受性及胆盐耐受性［3］。研究证明，L.casei Zhang可在小鼠肠道内定殖并对病原性大肠杆菌具有拮抗作用［4］，具有显著的抗氧化、降血脂、调节免疫、抑制肿瘤等功效［5-8］。其益生特性通过基因组学和蛋白质组学研究得到了进一步的验证［9-10］。

B.lactis V9分离自健康蒙古族儿童粪便中，具有稳定的遗传性［11］。B.lactis V9对人工胃肠液具有良好的耐受性［12］，对致病菌株(志贺氏痢疾杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、埃希氏大肠杆菌)具有一定程度的拮抗作用，可以有效治疗小鼠的腹泻［13］。临床研究表明，B.lactis V9具有调节肠道菌群的作用，对便秘和急慢性腹泻患者治疗效果显著［14］。

近几年，干酪乳杆菌因其特殊的生理功效及风味，被广泛应用于活性乳酸菌饮料中，且目前市场上常见的活性乳酸菌饮料几乎都是利用干酪乳杆菌单株菌发酵而成。本研究将L.casei Zhang与B.lactis V9复配添加到灭菌牛乳中发酵制备活性乳酸菌饮料，评价2株益生菌对活性乳酸菌饮料风味的影响及货架期内的存活稳定性，为L.casei Zhang与B.lactis V9在产品中的应用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

益生菌 LactobacilluscaseiZhang(L.casei Zhang)、Bifidobacterium lactis V9(B.animalis V9)，由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室友情提供。

1.2 发酵乳基料的制备

脱脂奶粉(12%)、葡萄糖(3%)(45℃水合30 min)→杀菌(95℃，5 min) →冷却至 3 7℃ →接种益生菌 →37℃恒温发酵 2 0 h →后熟12 h备用

不同样品中，L.casei Zhang与B.animalis V9的添加量见表1。

1.3 活性乳酸菌饮料样品的制备

白砂糖(12%)+稳定剂(CMC 0.3%、三聚磷酸钠0.03% ) →50℃ 温 水溶解 →杀菌(95℃，5 min) →冷却至 2 0℃ →加入发酵乳基料 →调整pH值至4.0→20 MPa 均质 →成品

表1 样品中L.casei Zhang和B.animalis V9的添加量Table 1 The addition of L.casei Zhang and B.lactis V9 in different samples

1.4 pH值测定

将活性乳酸菌饮料样品调整温度至20℃，采用精密pH计(雷磁PHS-3C，海精密科学仪器有限公司)测量。

1.5 活菌数测定

L.casei Zhang的选择性培养:将10.0 g活性乳酸菌饮料样品加入90.0 g蛋白胨水溶液(8.5 g/L NaCl，1.0 g/L 蛋白胨)中，于水平摇床(200 r/min)振摇30 min，然后于上述蛋白胨水溶液梯度稀释，采用MRS-V(万古霉素50 mg/L)固体培养基平板倾注法，37℃厌氧培养48 h。

B.animalis V9的选择性培养:10.0 g活性乳酸菌饮料样品于90.0 g PBS水溶液(8.0 g/L NaCl，0.20 g/L KH2PO4，1.15 g/L Na2HPO4，0.50 g/L 半胱氨酸)中，于水平摇床(200 r/min)振摇30 min，然后于上述PBS水溶液梯度稀释，采用莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin添加量为0.05 g/L)改良MRS琼脂培养基平板倾注法，37℃厌氧培养72 h。

1.6 活性乳酸菌饮料样品感官评定

活性乳酸菌饮料的感官评定标准见表2。

表2 活性乳酸菌饮料的感官评定标准Table 2 Sensory evaluation criteria of active lactobacillus beverage

2 试验结果与分析

2.1 不同发酵乳基料样品终点pH值比较

不同发酵乳基料在37℃下恒温发酵20 h后终点pH值如表3所示。

表3 不同发酵乳基料样品37℃恒温发酵20 h终点pH值比较Table 3 pH comparison of different sample fermented at 37℃for 21 h

由表3中结果可知，在37℃下恒温发酵20 h，益生菌添加活菌数量越高，发酵乳基料样品的终点pH值越低，其中，总添加量为2.0×107CFU/g时，pH值可达到4.00;总添加活菌数相同的前提下，B.animalis V9的添加会略延缓发酵乳基料样品酸度的降低速率，但无显著性差异(P＞0.05)。

2.2 贮藏期内不同活性乳酸菌饮料样品pH值的变化

贮藏期内不同活性乳酸菌饮料样品pH值变化见表4。

表4 不同活性乳酸菌饮料样品在4℃28 d贮藏期内pH值的变化Table 4 pH changes of differentactive lactobacillus beverage samples during the storage at 4℃for 28 d

由表4可以看出，4℃下贮藏28 d，不同样品的pH值均保持在4.00±0.05范围内不变，即6种活性乳酸菌饮料样品的酸度在货架期内均可以保持稳定的水平。

2.3 贮藏期内不同活性乳酸菌饮料样品中益生菌活菌数的变化

将活性乳酸菌饮料样品在4℃下贮藏28 d，不同样品中L.casei Zhang和B.animalis V9活菌数的变化见图1。

图1 不同活性乳酸菌饮料样品在4℃28 d贮藏期内益生菌活菌数的变化Fig.1 Changes of probiotics viable counts in different active lactobacillus beverage samples during the storage at 4℃for 28 d

由图1(a)可知，利用L.casei Zhang单独发酵制备活性乳酸菌饮料的最适添加量为1.0×107CFU/g，37℃下恒温发酵20 h后按照1.3中工艺调配，活性乳酸菌饮料样品中L.casei Zhang的活菌数达到3.0×108CFU/g以上，且在4℃ 28 d贮藏期内保持高于3.0×108CFU/g水平。

由图1(b)可知，贮藏期内L.casei Zhang+B.animalis V9(1∶1，2.0×107CFU/g)活性乳酸菌饮料样品中总的益生菌活菌数可以达到5.0×108CFU/g以上，其中L.casei Zhang的初始活菌数约为3.7×108CFU/g，且在4℃ 28 d贮藏期内保持高于3.7×108CFU/g水平;B.animalis V9的活菌数在贮藏期内呈逐渐增加的趋势，第28天增加至2.7×108CFU/g。说明B.animalis V9与L.casei Zhang共同发酵发生协同效应，B.animalis V9的添加可促进 L.casei Zhang的增殖。

由图1(c)可知，贮藏期内L.casei Zhang+B.animalis V9(1∶1，1.0×107CFU/g)活性乳酸菌饮料样品中总的益生菌活菌数可以达到3.5×108CFU/g以上，其中L.casei Zhang的初始活菌数约为2.5×108CFU/g，后期逐渐减少，第28天时最低约为2.0×108CFU/g;B.animalis V9的活菌数在28 d贮藏期内保持约1.5×108CFU/g水平稳定不变。

由图1(d)中结果可知，贮藏期内L.casei Zhang+B.animalis V9(1∶1，0.5×107CFU/g)活性乳酸菌饮料样品中总的益生菌活菌数小于3.0×108CFU/g，其中L.casei Zhang的初始活菌数约为2.5×108CFU/g以上，后期逐渐减少，第28天时最低约为1.5×108CFU/g;B.animalis V9的活菌数在28 d贮藏期内保持约0.5×108CFU/g水平稳定不变。

2.3 不同活性乳酸菌饮料样品感官评价结果

组织11名专业感官评价人员按照表2中标准对6种不同活性乳酸菌饮料进行感官评定，结果见表5。

由表5可以看出，将L.casei Zhang与B.animalis V9按照活菌数1∶1复配，总活菌数添加量为2.0×107CFU/g时，制备的活性乳酸菌饮料在口感和滋气味方面更有优势。

表5 不同活性乳酸菌饮料样品感官评价结果Table 5 Sensory evaluation result of differentactive lactobacillus beverage samples

3 讨论

目前市场上的活性乳酸菌饮料几乎都是通过干酪乳杆菌单株菌长时间发酵调配而成的，国内该类产品的产量逐年攀升，养乐多、味全、蒙牛、伊利相继推出该类产品［15］。货架期内酸度、风味及乳酸菌活菌含量是活性乳酸菌饮料产品质量高低评价的重要指标。研究结果显示:

(1)当总乳酸菌添加量为2.0×107CFU/g时，发酵乳基质的pH值可达到理想值4.00。

(2)利用L.casei Zhang单独发酵制备活性乳酸菌饮料的最适添加量为1.0×107CFU/g，4℃ 28 d贮藏期内保持高于3.0×108CFU/g水平。

(3)最佳复配发酵组合为L.casei Zhang+B.animalis V9(1∶1，2.0×107CFU/g)，4 ℃ 28 d贮藏期内样品中总的益生菌活菌数保持5.0×108CFU/g以上，且在口感和滋气味方面感官评价分值最高。

由此可见，益生菌L.casei Zhang和B.animalis V9适合用于活性乳酸菌饮料产品的开发，2株菌在共同发酵过程中会发生协同效应，B.animalis V9的添加可促进L.casei Zhang的增殖，且有利于改善L.casei Zhang单株发酵样品的感官品质。

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