低温乳酸菌发酵泡白菜有机酸和游离氨基酸含量分析*

张梦梅，李小艳，胡露，周康，2，敖晓琳，2，何利，2，陈姝娟，2，刘书亮，2

1(四川农业大学食品学院，四川雅安，625014)

2(农产品加工及贮藏工程四川省重点实验室，四川雅安，625014)

泡菜是以新鲜蔬菜为原料，经盐渗透、微生物发酵、香辛料增香作用而形成的浸渍品［1］，具有多种保健功能［2-4］，深受消费者喜爱。评价泡菜品质的重要指标之一是风味物质，其包括挥发性和不挥发性成分，不挥发性成分包括有机酸和氨基酸。有机酸是泡菜的味感物质基础，氨基酸是主要的鲜味物质［5］，同时也是许多风味物质的前体［6-7］。泡菜的风味物质来源于蔬菜和香辛料自身含有的呈味物质，发酵过程中微生物的代谢产物，发酵过程中酸、醇、醛类等反应形成的产物［8］。由于目前泡菜企业生产使用较多的乳酸菌为中温型微生物，其发酵周期短，易过酸和过熟，然而生产上蔬菜的收获和盐渍多集中在冬季，中温型乳酸菌对泡菜的发酵速度过慢而限制了工业化生产。另外，蔬菜表面的附生微生物中部分为致腐菌甚至可能存在致病菌，在泡菜发酵前期可能生长繁殖影响泡菜的安全性和品质，所以常用12%以上盐度进行控制。耐低温乳酸菌的应用，不仅可以解决这一生产问题，而且在一定程度上可以抑制泡菜中杂菌的生长，减少败坏，降低亚硝酸盐含量，保持独特的口感和风味［9］。本文以课题组［10］筛选的耐低温植物乳杆菌和肠膜明串珠菌为菌种，采用前期研究优化得到的2种不同菌种配比的人工发酵方式，比较分析低温下2种人工发酵和老盐水发酵泡白菜过程中的有机酸和游离氨基酸含量变化，为感官评价提供数据参考，同时为改进泡菜生产工艺、提高产品质量和风味品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白菜、芹菜、生姜、大蒜、白糖、食盐、白酒、青花椒、小红椒、八角、香叶，均为市售。

植物乳杆菌(Lactobacilusplantarum)3m-1，肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)8m-9，分离于四川泡菜。

草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、乳酸、乙酸，均为色谱纯。

1.2 方法

1.2.1 泡白菜制作

(1)菌剂制备:将菌种活化后，在10℃条件下用改良蔬菜汁培养基培养72 h得到菌液，离心(2 700 r/min，10 min)，得到菌剂。

(2)白菜预处理:清洗，晾干，切分。

(3)泡白菜制作:实验分为3组。低温乳酸菌接种①:所用菌种为菌株8m-9，接种量为0.3%。装罐时，盐水由食盐40 g/L，蔗糖40 g/L，香料汁16%，3 g/L CaCl2，白酒1%组成，蔬菜与盐水的比例为1∶1，密封后置于10℃发酵。低温乳酸菌接种②:所用菌种为菌株3m-1∶8m-9=2∶1，接种量为0.3%。装罐时，盐水由食盐50 g/L，蔗糖20 g/L，香料汁16%，3 g/L CaCl2，白酒1%组成，其余同低温乳酸菌接种①。老盐水:不接种。装罐时，向坛内加的盐水(食盐含量50 g/L)是用从雅安市雨城区部分餐馆收集的泡菜水与水按1∶1混合而成的，其余同低温乳酸菌接种①。

1.2.2 有机酸测定

(1)样品处理根据发酵方式与发酵周期的不同，取1.2.1 中低温乳酸菌接种①(1、2、3、5、9、13、20 d)、低温乳酸菌接种②(1、2、3、5、9 d)、老盐水(1、2、3、5、11 d)3种发酵方式样品100 g，捣碎后称取5 g于50 mL容量瓶，加水定容。浸泡1 h(期间每隔20 min混匀1次)后过滤，取上清液，12 000 r/min离心5 min，取上清液，0.45 μm微孔滤膜过滤器过滤，收取滤液进行检测。配制标准使用液(草酸2.5 mg/mL、柠檬酸15 mg/mL、酒石酸25 mg/mL、苹果酸15 mg/mL、琥珀酸15 mg/mL、乳酸25 mg/mL、乙酸 30 mg/mL)，分别取2、10、50、75、100 μL，用超纯水稀释至 1 mL，0.45 μm微孔滤膜过滤器过滤，收取滤液进行检测［11-12］。

(2)检测条件色谱柱:Carbomix H-NP柱(10 μm，8%交联度，7.830 0 mm);流动相:2.5 mmol/L H2SO4;柱温:58℃;进样量:5 μL;流速:0.6 mL/min;紫外检测器波长:210 nm。以此条件建立标准曲线，并对样品进行定量。

1.2.3 游离氨基酸测定

根据发酵方式与发酵周期的不同，取原料及1.2.1中低温乳酸菌接种①(5、20 d)、低温乳酸菌接种②(5、9 d)、老盐水(5、11 d)3 种发酵方式样品100 g，放入60℃烘箱烘干至恒重，研磨过筛(60目)，样品送国家粮食局成都粮油食品饲料质量监督检验测试中心测定游离氨基酸含量［13］。

1.2.4 泡白菜的感官评价

取1.2.1中低温乳酸菌接种①(20 d)、低温乳酸菌接种②(9 d)、老盐水(11 d)3种发酵方式泡白菜成熟样品，邀请10名具有食品专业背景的学生和老师组成评定小组依据文献［14-16］对泡菜的形态、色泽、口感、口味、气味、脆度进行感官评定(总体得分=形态×10%+色泽×10%+气味×20%+口味×30%+脆度×30%)。

1.2.5 数据处理

采用Excel对数据进行统计分析，采用SPSS.19进行差异显著性(P＜0.05)分析。

2 结果与分析

2.1 泡白菜有机酸含量变化

2.1.1 有机酸标准品的HPLC图谱及标准曲线线性相关性

有机酸标准品的HPLC图谱如图1所示，7种有机酸分离效果好。由表1可知，所测的7种有机酸的相关系数均大于0.999 0，说明相关性好，所测数据可靠。

图1 7种有机酸标准图谱Fig.1 The standard map of 7 standard organic acid

表1 7种有机酸标准曲线线性相关性Table 1 Liner equations for the standard curve of 7 standard organic acids

2.1.2 不同发酵方式制作泡白菜发酵过程中有机酸含量变化

利用高效液相色谱法对不同发酵方式制作泡白菜发酵过程中有机酸含量的测定结果见图2、图3、图4。

由图2、图3和图4可知，3种不同发酵方式泡白菜中的大多数有机酸的变化趋势基本一致，但在幅度上存在一定的差异。泡菜发酵过程中共检测出了6种有机酸，其中乙酸酸味较刺激，可以强化食欲;乳酸酸味柔和，有后酸味;苹果酸有助于形成泡菜爽口的酸味;琥珀酸赋予泡菜类似于贝类的鲜味［11］。3种发酵方式均未检出酒石酸，其原因可能是在发酵过程中被微生物分解利用或含量太少导致低于检出限。苹果酸、乳酸、乙酸在发酵过程中均呈增长趋势，其中乳酸含量增长最多，可知发酵过程中生成的有机酸以乳酸为主。发酵结束时，草酸、柠檬酸和琥珀酸的含量与发酵初期相比，均呈现出下降的趋势，可能是参与了微生物的代谢过程。老盐水中微生物复杂，存在其他产酸菌株，故发酵过程中乳酸含量较高。低温乳酸菌发酵①与低温乳酸菌发酵②相比，草酸、苹果酸和乙酸含量较多，而乳酸含量低，分析原因是低温乳酸菌发酵①中使用的菌株8m-9为肠膜明串珠菌，进行异型乳酸发酵，产生乳酸的同时也产生乙醇和二氧化碳。3种方式发酵过程中，琥珀酸含量虽然均有减少，但低温乳酸菌发酵的琥珀酸含量明显高于老盐水发酵，可能是发酵过程中乳酸菌产生了琥珀酸［17］。

图2 低温乳酸菌接种①发酵过程中有机酸变化Fig.2 Changes of organic acids during artificial inoculation①fermentation process

图3 低温乳酸菌接种②发酵过程中有机酸变化Fig.3 Changes of organic acids during artificial inoculation②fermentation process

图4 老盐水发酵过程中有机酸变化Fig.4 Changes of organic acids during aged bring fermentation process

2.2 不同发酵方式制作泡白菜发酵过程中游离氨基酸变化

3种发酵方式泡白菜发酵过程中游离氨基酸含量的测定结果见表2。由表2可知，从泡菜样品中共检测出了17种氨基酸组分。3种发酵方式的氨基酸种类相同，但含量各不相同，可能与发酵环境中微生物的群落结构有关。3种发酵方式的游离氨基酸总量均有不同程度的减少，其中老盐水发酵泡菜的总氨基酸下降幅度较大(P＜0.05)，从发酵前的291.20 mg/100g降至发酵后的120.58 mg/100g。发酵后期，低温乳酸菌接种发酵泡白菜中的必需氨基酸含量明显高于老盐水发酵泡白菜中的含量(P＜0.05)。发酵后期，3种发酵方式生产出的泡白菜中的必需氨基酸(EAA)占氨基酸总量(TAA)的48.41%、49.49%、29.91%，必需氨基酸与非必需氨基酸(NEAA)的比值分别为 93.84%、97.98%、42.67%。2种低温乳酸菌发酵泡白菜都符合FAO/WHO所提出的较好的氨基酸组成为EAA/TAA在40%，EAA/NEAA在60%以上的标准［18］。低温乳酸菌发酵泡白菜中的天冬氨酸和精氨酸的含量也同样高于老盐水发酵泡白菜中的含量，天冬氨酸是生物体内赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸等必需氨基酸及嘌呤、嘧啶碱基的合成前体［19］;精氨酸作为半必需氨基酸，对人体来说同样重要，如体内缺少精氨酸会导致血氨过高，影响机体正常的生长和发育［20］。

表2 不同发酵方式泡白菜发酵过程中游离氨基酸成分表Table 2 Free amino acid compounds during cabbage fermentation process with different fermentation methods

氨基酸不仅是维持机体正常代谢的重要物质，还具有调和风味的作用。根据氨基酸对滋味的贡献，可以分为4类:鲜味氨基酸、甜味氨基酸、酸味氨基酸和苦味氨基酸［14，21］。3种发酵方式的泡白菜成品中的甜味氨基酸含量分别占氨基酸总量的60.35%、61.65%、67.94%，苦味氨基酸较发酵前含量略有减少。低温乳酸菌接种发酵泡白菜中的天冬氨酸和谷氨酸，经过发酵含量显著增加，而老盐水发酵中的这2种氨基酸则明显下降(P＜0.05)。天冬氨酸和谷氨酸与Na+结合时会使产品鲜味倍增［22］，赋予泡菜更鲜美的滋味，使得人工接种泡菜风味更佳。

2.3 不同发酵方式制作的泡白菜感官评价结果

通过对3种发酵方式的成熟泡白菜进行感官评价，结果表明，低温乳酸菌接种①、低温乳酸菌接种②、老盐水的泡白菜的感官评分分别为85.77±2.27，84.22±2.87，82.32±2.68，3者之间差异不显著(P＞0.05)，但低温乳酸菌接种发酵泡白菜略优于老盐水发酵泡白菜，这与测定的有机酸组成及游离氨基酸含量基本一致。

3 讨论与结论

本文研究了低温条件下3种不同发酵方式制作的泡白菜样品中有机酸和游离氨基酸含量的变化。人工接种发酵泡菜与自然发酵泡菜均检测到了6种有机酸和17种游离氨基酸。这3种发酵方式制得的泡白菜样品中的有机酸的变化趋势基本一致，只是变化幅度有所不同，与朱文娴等［23］的研究结果类似。对比发酵末期样品中各有机酸的含量，可以看出人工发酵泡菜中柠檬酸、苹果酸、琥珀酸的含量较老盐水发酵泡菜中的含量丰富。其中，柠檬酸和苹果酸的味道醇和、刺激性小［24］，琥珀酸能赋予产品贝类的鲜味，使得泡菜风味更佳。发酵末期，人工发酵泡菜样品中的氨基酸总量、EAA/TAA、EAA/NEAA含量均大于老盐水发酵泡菜，不同于黄业传等［25］得出的人工接种发酵蔬菜产品中的氨基酸总含量略低于自然发酵的结果。从有机酸和游离氨基酸种类与含量，以及感官评价结果来看，可用低温乳酸菌接种发酵方式代替老盐水发酵。

常温乳酸菌发酵速度快周期短，产品易过酸和过熟。为防止蔬菜变质保证产品安全，生产上常增加食盐的使用量，不仅影响口感，且增加了食盐使用成本，甚至盐渍蔬菜脱盐后可导致盐水排放污染环境进而增加废水处理成本。而低温乳酸菌发酵能很好地解决泡菜企业冬季盐渍蔬菜发酵受低温限制以及用盐量较高的生产问题，产品风味也更加饱满、柔和。虽然发酵周期略长，但发酵过程易于控制，可提升泡菜产品的品质。老盐水发酵体系中杂菌较多，菌群结构复杂多变，产品的质量与风味难以维持稳定，难以适应规模化、产业化发展。故选择合适的发酵剂进行人工接种，以实现大规模工业化生产非常必要。本文结果显示，人工接种低温乳酸菌发酵泡菜能达到老盐水发酵泡菜的感官风味品质，一些品质指标甚至优于老盐水发酵泡菜。研究结果为实现低温乳酸菌接种发酵生产泡菜提供了理论依据，对提高产品质量、降低食盐使用成本有重要意义。

［1］ 卢沿钢，董全.中、日、韩三国泡菜加工工艺的对比［J］.食品与发酵科技，2011(4):5-9.

［2］ Kim B，Park K Y，Kim H Y，et al.Anti-aging effects and mechanisms of kimchi during fermentation under stress-induced premature senescence cellular system［J］.Food Science and Biotechnology，2011，20(3):643-649.

［3］ Jung K，Park K，Bullerman L B.Anticancer Effects of Leek Kimchi on Human Cancer Cells［J］.Nutraceuticals and Food，2002，7(3):250-254.

［4］ 邹华军，石磊，张其圣，等.发酵泡菜对高脂血症大鼠的干预效果研究［J］.现代预防医学，2013，40(23):4 309-4 311.

［5］ Steinkraus K H.Classification of fermented foods:worldwide review of household fermentation techniques［J］.Food Control，1997，8(5):311-317.

［6］ Christensen J E，Dudley E G，Pederson JA，et al.Peptidases and amino acid catabolism in lactic acid bacteria［J］.Antonie van Leeuwenhoek，1999，76(1):217-246.

［7］ 张菊华，单杨，李高阳.乳酸菌发酵蔬菜汁的呈味作用［J］.湖南农业科学，2004(1):67-70.

［8］ 燕平梅，薛文通.乳酸菌与发酵蔬菜的风味［J］.中国调味品，2005(2):12-15.

［9］ Rhee S J，Lee J，Lee C.Importance of lactic acid bacteria in Asian fermented foods［J］.Microbial Cell Factories，2011，10(Suppl 1):S5.

［10］ 李小艳，刘书亮，蒲彪，等.泡菜中低温乳酸菌的筛选及其特性研究［J］.中国食品学报，2014，14(10):108-116.

［11］ 王晓飞.纯种发酵泡菜及其风味物质的研究［D］.南京:南京工业大学，2005.

［12］ 徐娟娣.倒笃菜风味物质变化及其工业化生产关键技术研究［D］.杭州:浙江大学，2013.

［13］ 卢珍华，郭彩华.AccQ·Tag法测定绿豆蛋白酶解液中的氨基酸含量［J］.食品科学，2006，27(2):238-241.

［14］ 刘洪.自然发酵与人工接种泡菜发酵过程中品质变化规律的动态研究［D］.成都:西华大学，2012.

［15］ 陈功.中国泡菜的品质评定与标准探讨［J］.食品工业科技，2009(2):335-338.

［16］ 张艾青.产广谱细菌素植物乳杆菌的初步研究及其在泡菜中的应用［D］.雅安:四川农业大学，2007.

［17］ 徐丹萍，蒲彪，卓志航.传统泡菜中乳酸菌对风味的影响［J］.食品与发酵工业，2014，40(2):170-173.

［18］ 天津工业学院无锡轻工业学院.食品生物化学［Z］.北京:中国轻工业出版社，2002:213-214.

［19］ 任浩，宿树兰，管汉亮，等.银杏花粉中核苷、氨基酸及无机元素的成分分析［J］.中草药，2014(19):2 839-2 843.

［20］ 刘兆金，印遇龙，邓敦，等.精氨酸生理营养研究［J］.氨基酸和生物资源，2005(4):54-57.

［21］ 武彦文，欧阳杰.氨基酸和肽在食品中的呈味作用［J］.中国调味品，2001(1):21-24.

［22］ 杜书.酸菜自然发酵过程中风味及质地变化规律研究［D］.沈阳:沈阳农业大学，2013.

［23］ 朱文娴，周相玲，张惠，等.人工接种泡菜的风味研究［J］.食品工业科技，2007(11):108-110.

［24］ 苏扬，陈云川.泡菜的风味化学及呈味机理的探讨［J］.中国调味品，2001(4):26-29.

［25］ 黄业传，曾凡坤.自然发酵与人工发酵泡菜的品质对比［J］.食品工业，2005(3):41-43.