漆酶介体催化的研究进展

谢 军 张思婧 陈洪章

（中国科学院过程工程研究所生物质炼制工程北京市重点实验室，北京 100190）

漆酶介体催化的研究进展

谢 军 张思婧 陈洪章

（中国科学院过程工程研究所生物质炼制工程北京市重点实验室，北京 100190）

谢军，中国科学院过程工程研究所，硕士研究生，从事生物质工程的研究工作。

E-mail:xiejun14@mails.ucas.ac.cn

漆酶，又称酚酶，是一类可有效降解木质素的含铜多酚氧化酶，在氧气存在的条件下能够氧化降解木质素的酚型结构单元，在某些具有传递电子能力的介体作用下，对木质素的非酚型结构单元也有较好的降解效果（漆酶一般只能催化氧化酚型底物，无法作用于非酚型底物，介体的加入可通过电子传递实现漆酶对非酚型底物的催化氧化）。作为一种多功能金属氧化酶，漆酶具有宽泛的催化底物谱，且其催化氧化反应条件温和，反应副产物为水，是一种“绿色催化剂”，成为近年来生物酶催化领域的研究热点。目前对于漆酶介体催化的研究涉及制浆造纸、污水处理、环境毒物降解、食品加工、材料合成及药物合成等各个领域。但是，合成介体存在成本高、毒性大、易使漆酶失活等缺点，而成分单一的天然介体在提纯制备过程中存在成本问题，从而制约了其进一步应用。研究表明，木质素降解过程中产生的酚类物质作为漆酶介体，在漆酶催化过程中可促进漆酶氧化，可作为未来漆酶催化介体的一个新研究方向。

1 漆酶结构及催化机理

自然界中真菌漆酶的氧化还原电位较低（0.5～0.8V），只能氧化降解具有低氧化还原电势的木质素结构的酚型单元，而不能氧化降解木质素结构的非酚型单元。漆酶具有3个铜离子结合位点（T1、T2、T3），一般结合4个铜离子。这4个铜离子分别为I型铜，Ⅱ型铜和Ⅲ型铜，分别与T1、T2和T3结合，其中I型铜在T1位点与3个氨基酸配位（包括2个组氨酸、1个半胱氨酸），Ⅱ型铜在T2位点与2个组氨酸和1个水分子配位，Ⅲ型铜在T3位点包括2个铜离子，这2个铜离子分别与3个组氨酸配位，2个Ⅲ型铜之间通过氢氧桥配位。漆酶催化过程中，底物首先在T1位点被氧化，释放出电子被T1位的铜捕获，经半胱氨酸传递给与T2位的铜结合的组氨酸，再进一步将氧分子还原为水。

邱卫华, 陈洪章. 木质纤维素原料中漆酶天然介体的研究进展. 生物工程学报, 2014, 30:726-733.

Xie T, Liu Z, Liu Q, et al. Structural insight into the oxidation of sinapic acid by CotA laccase. J Struct Biol, 2015 ,190:155-161.

Murugesan K, Chang Y Y, Kim Y M, et al. Enhanced transformation of triclosan by laccase in the presence of redox mediators. Water Res, 2010, 44:298-308.

Kunamneni A, Camarero S, García-Burgos C, et al. Engineering and applications of fungal laccases for organic synthesis. Microb Cell Fact, 2008, 7:32.

Camarero S, Ibarra D, Martínez M J, et al. Lignin-derived compounds as efficient laccase mediators for decolorization of different types of recalcitrant dyes. Appl Environ Microb, 2005, 71:1775-1784.

Könst P, Kara S, Kochius S, et al. Expanding the scope of laccase‐mediator systems. Chem Cat Chem, 2013, 5:3027-3032.

Kudanga T, Le Roes-Hill M. Laccase applications in biofuels production: current status and future prospects. Appl Microbiol Biota, 2014, 98:6525-6542.

Bibi I, Bhatti H N, Asgher M. Comparative study of natural and synthetic phenolic compounds as efficient laccase mediators for the transformation of cationic dye. Biochem Eng J, 2011, 56:225-231.

2 漆酶介体催化进展

许多底物由于体积过大难与漆酶的活性部位结合，或者由于氧化还原电位高于漆酶而不能直接氧化。漆酶介体的加入就是基于电子转移、氢转移、离子氧化等不同的催化机制实现漆酶与非酚类及大分子木质素等底物间的电子传递。漆酶介体催化最本质的机理是漆酶催化底物产生自由基，自由基之间通过电子传递实现漆酶对底物的最终氧化。Xie等研究发现Cot A漆酶与介体作用的关键位点是酚酸结构邻位的甲氧基。Murugesan等分别以HBT（1-羟基苯并三唑）、丁香醛做介体降解抗菌剂TCS（二氯苯氧氯酚），结果表明，用HBT降解TCS生成2,4-二氯苯酚，用丁香醛降解TCS生成2-氯对苯二酚。

漆酶催化的常用介体是一些酚型化合物和杂环物质，可分为天然介体和合成介体。合成介体中，研究较多的是2,2-联氨-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）、1-羟基苯并三唑（HBT）、紫脲酸（VIO）、N-羟基-N-乙酰基苯胺（NHA）、2,2,6,6-四甲基哌啶（TEMPO）、吩噻嗪等杂环化合物。这些合成介体大都有毒且价格昂贵，而且还可能影响漆酶的活性及稳定性，于是研究人员开始寻找稳定高效、低毒价廉的天然介体。来源于木质素降解产物的3-羟基邻氨基苯甲酸和来源于真菌次生代谢产物的紫丁香醛等天然介体已开始被研究。Camarero等首次利用木素小分子酚类衍生物作为漆酶的天然介体，对不同染料进行脱色，研究发现乙酰丁香酮、乙酰香草酮、对香豆酸、二甲基苯酚、乙基香草醛、甲基香草酸酯、丁香醛、三甲氧基苯酚、香草醛和香草醇等一些衍生自木素的酚醛类小分子都能作为漆酶催化的天然介体，促进染料脱色。Könst等在研究漆酶介体体系（LMS）促进乙醇脱氢酶（ADH）催化裂解氧化反应中，发现咖啡酸、绿原酸、丁香醛和乙酰丁香酮、木质素酚类都是有效的天然介质。Kudanga等研究发现，木质素降解产生的乙酰丁香酮、没食子酸、香草醇、抗癫香素、紫丁香酸、对香豆酸、丁香醛、3-羟基-2-氨基苯甲酸、邻苯二酚、2,6-二甲酚、2,4,6-三甲基苯酚、香荚兰乙酮、乙基香兰素、介子酸、阿魏酸、对羟基苯甲酸、肉桂酸、松伯醇等小分子物质都是良好的漆酶天然介体。邱卫华等总结了木质素分解产物中漆酶天然介体的研究进展，从汽爆秸秆水洗液、造纸黑液和木质纤维素生物降解产物等方面论述了从木质纤维素原料降解产物中分离漆酶天然介体并进行应用的可能性。

从目前的研究来看，许多天然介体与合成介体的催化降解效果相当，甚至优于合成介体。Andreu等比较了天然介体丁香醛和乙酰丁香酮与HBT介体对红麻脱木素效果的影响，结果显示天然介体可以替代HBT。Moreira等比较了丁香醛、HBA（4-hydroxybenzoic acid）、HBT、DOPAC（4-dihydroxiphenilacetic acid）、2,3DHBA（2,3-dihydroxybenzoic acid）5种不同介体对活性蓝19（染料）的脱色效果，结果表明丁香醛作介体时脱色效果最好，比单独使用漆酶时脱色效率提高3倍。Gutiérrez等用木质素降解物作为天然介体替代HBT等合成介体，去除了制浆中的脂溶性物质。Struch等以香草醛、香草酸和咖啡酸为介体，漆酶催化脱脂酸奶，使其流变性能和食品口感发生改变。

但是，目前的研究内容仍然是以合成介体为主，天然介体由于提取纯化成本较高，导致应用受限。因此，寻找一种新的、制取工艺简单、分离成本低的天然介体系统，对于漆酶催化具有重要意义。

3 漆酶介体催化应用

漆酶作为一种多功能金属氧化酶，具有宽泛的催化底物谱，不仅能催化酚类和芳香胺类化合物氧化，也能降解多环芳烃等难降解物质。因此，漆酶介体体系可应用于木质素生物降解、纸浆改性、造纸废水处理、染料废水脱色、环境污染物的脱除以及多环芳烃降解等多个领域。

3.1 环境污染物的脱除

农药尤其是含氯的芳香类化合物的过度使用严重污染环境，利用漆酶可以降解氯酚类等环境污染物。Mir-Tutusaus等研究了云芝漆酶/ABTS系统对生物农药imiprothrin（IP）、oxytetracycline（OTC）、cypermethrin（CP）、carbofuran（CBF）的降解，发现IP、OTC、CP、CBF均可以得到有效降解，且降解速率IP>OTC>CP>CBF。Prieto等用白腐菌/ABTS降解抗生素药物环丙沙星和诺氟沙星，使其毒性有效降低。Arca-Ramos和Liu等分别以HBT和ABTS为漆酶介体，对蒽、苊进行降解。

3.2 脱色脱毒

Jeon J R, Murugesan K, Kim Y M, et al. Synergistic effect of laccase mediators on pentachlorophenol removal by Ganoderma lucidum laccase. Appl Microbiol Biota, 2008, 81:783-790.

Andreu G, Vidal T. Effects of laccasenatural mediator systems on kenaf pulp. Bioresoure Technol, 2011, 102:5932-5937.

Moreira S, Milagres A M, Mussatto S I. Reactive dyes and textile effluent decolorization by a mediator system of salt-tolerant laccase from Peniophora cinerea. Sep Purif Technol, 2014, 135:183-189.

Gutiérrez A, Rencoret J, Ibarra D, et al. Removal of lipophilic extractives from paper pulp by laccase and lignin-derived phenols as natural mediators. Environ Sci Technol, 2007, 41:4124-4129.

Struch M, Linke D, Mokoonlall A, et al. Laccase-catalysed cross-linking of a yoghurt-like model system made from skimmed milk with added food-grade mediators. Int Dairy J, 2015,49:89-94.

Mir-Tutusaus J A, Masís-Mora M, Corcellas C, et al. Degradation of selected agrochemicals by the white rot fungus Trametes versicolor. Sci Total Environs, 2014, 500:235-242.

Prieto A, Möder M, Rodil R, et al. Degradation of the antibiotics norfloxacin and ciprofloxacin by a white-rot fungus and identification of degradation products. Bioresource Technol, 2011, 102:10987-10995.

Arca-Ramos A, Eibes G, Moreira M T, et al. Mass transfer enhancement by the addition of surfactant in a two phase partitioning bioreactor for the degradation of anthracene by laccase. Chem Eng J, 2012, 27.

在纺织工业中，染料成分通常是芳烃化合物，一般很难被降解，用一般的物理化学方法对纺织废水很难达到脱色脱毒的效果，且费用较高。Benzina等以HBT为介体成功地对纺织工业废水进行脱毒处理。Yang等的研究表明，以低毒的乙酰丙酮作为介体，利用LMS对污水脱色脱毒，比以HBT为介体更稳定，而且可循环使用。

Liu Y, Hua X. Degradation of acenaphthylene and anthracene by chemically modified laccase from Trametes versicolor. Rsc Adv, 2014, 4:31120-31122.

钢铁工序利用钢渣在我国得到广泛应用，但是由于钢渣中的P元素含量较高，在烧结或高炉等工序中利用不能过量，以磷为例，近年来高磷铁矿的使用必然造成铁水脱磷后钢渣磷含量上升，如果将钢渣大比例和持续循环利用，将容易造成磷循环富集，加大后期炼钢生产负担。

Benzina O, Daâssi D, Zouari-Mechichi H, et al. Decolorization and detoxification of two textile industry effluents by the laccase/1-hydroxybenzotriazole system. Eniviron Sci Pollut R, 2013, 20:5177-5187.

Yang H, Sun H, Zhang S, et al. Potential of acetylacetone as a mediator for Trametes versicolor laccase in enzymatic transformation of organic pollutants. Environ Sci Pollut R, 2015:1-8.

Xu Q, Wang Y, Qin M, et al. Fiber surface characterization of old newsprint pulp deinked by combining hemicellulase with laccase-mediator system. Bioresource Technol, 2011, 102:6536-6540.

Shumakovich G, Otrokhov G, Vasil’eva I, et al. Laccase-mediated polymerization of 3, 4-ethylenedioxythiophene(EDOT). J MOL Catal B-Enzym, 2012, 81:66-68.

Ganachaud C, Garfagnoli V, Tron T, et al. Trimerisation of indole through laccase catalysis. Tetrahedron Lett, 2008, 49:2476-2478.

Piccinino D, Delfino M, Botta G, et al. Highly efficient synthesis of aldehydes by layer by layer multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) laccase mediator systems. Appl Catal A-Gen, 2015, 499:77-88.

3.3 纸浆改性

由于漆酶可以氧化或降解木质素，其在造纸中的应用主要集中在脱墨、废水处理和改善纸浆湿强度等方面。研究结果表明，经漆酶处理可以有效提高纸浆的湿强度；纸浆中木素含量越高，漆酶改善纸浆性能的效果越明显。漆酶/介体体系可通过氧化降解纸浆表面的木素来达到脱除油墨的目的。Xu等以紫脲酸为漆酶介体，发现半纤维素酶与LMS有协同脱墨的效果。

3.4 有机合成

漆酶催化有机物的合成的操作简单、反应条件温和且毒副产物较少，在介质存在的情况下，可催化多种合成反应。漆酶催化的聚合反应，能够生成一些传统化学法不可能合成的聚合物。通常认为在聚合反应过程中，首先底物传递给漆酶一个电子，形成底物自由基，然后底物自由基与其他分子耦联产生二聚体、三聚体乃至多聚体。Shumakovich等以 KMo（CN）做介体，将EDOT

38（3,4-ethylenedioxythiophene）聚合成低聚物，应用于晶体管、发光二极管及光电池领域。Mathew等将氧化马铃薯淀粉的伯羟基选择性地氧化成醛和羧酸，以TEMPO为介体，低水平的氧化适用于表面施胶，而高度氧化淀粉用于制备纸张涂料、涂料和树脂。Ganachaud等用TEMPO做介体，催化吲哚三聚。Piccinino等用碳纳米管固定漆酶，漆酶/TEMPO和ABTS介体催化高效成醛反应。Molina等采用漆酶/HBT系统氧化不饱和脂肪，产物主要是环氧脂肪酸和羟基脂肪酸，而甾醇氧化产物多为甾酮。

此外，漆酶还能催化酚类或芳胺类底物氧化合成新型化合物，如各种药物、氨基酸、多肽等。Galletti等以TEMPO作为介体，漆酶催化苄胺合成醛亚胺，用于抗肿瘤药物的合成。Kochius等用ABTS为介体，LMS系统原位再生烟酰型辅酶（NADP），在制药、食品、精细化工、农药等领域有重要应用。

4 木质素降解产物中的漆酶介体

实际上，木质纤维素原料汽爆水洗液可以看做是一个包含多种小分子木质素降解产物的混合介体体系。已有研究表明，在不同介体组成的混合体系中，介体之间存在漆酶催化底物反应的连续电子传递。因此，木质素降解物包含的酚类物质可以组合在一起作为漆酶的天然介体组催化漆酶应用。

人工合成的漆酶催化介体存在成本高、毒性大、易使漆酶失活等缺点，而一般所说的漆酶天然介体指的是单一成分的介体，存在分离纯化成本高的问题，因此漆酶催化一直未在工业上得到广泛应用。木质素降解物的天然介体组合具有原料易得、制取工艺简单等特点，在催化漆酶染料脱色和合成环氧化物方面均取得成功。所以，从木质纤维素原料的降解物（如汽爆水解液）中提取高性能漆酶天然介体可以作为未来漆酶介体发展的一个重要方向。

5 结论与展望

漆酶介体催化体系的底物范围宽泛，有广阔的应用领域。目前应用的漆酶介体催化体系中，大多数还是采用合成介体，如ABTS、HBT、TEMPO等，但是存在价高、有毒、影响漆酶活性等问题，而单一组分的漆酶天然介体提取纯化工艺复杂，导致成本较高，这都限制了漆酶介体催化体系在工业上的应用。寻找稳定、高效、低毒和价廉的天然介体仍是当前的研究重点。木质素降解产生的酚类物质等已经被证明是良好的漆酶天然介体，但是，目前关于这些酚类物质产生和迁移机理尚未明确，其在漆酶的催化体系中的具体作用及其对漆酶活性的影响还有待深入研究，而且此类小分子物质获取的浓度一般较低，成分复杂，分离纯化的成本较高有待降低。因此，高效、低成本、低毒地构建漆酶天然介体催化体系，是未来漆酶工业化应用的研究重点。

［本研究得到国家重点基础研究发展计划（“973”计划）（No. 2011CB707401）资助。］

Molina S, Rencoret J, José C, et al. Oxidative degradation of model lipids representative for main paper pulp lipophilic extractives by the laccase‐mediator system. Appl Microbiol Biot, 2008, 80:211-222.

Galletti P, Funiciello F, Soldati R, et al. Selective oxidation of amines to aldehydes or imines using laccase‐mediated bio‐oxidation. Adv Synth Catal, 2015, 357(8):1840-1848.

Kochius S, Ni Y, Kara S, et al. Light‐accelerated biocatalytic oxidation reactions. Chem Plus Chem, 2014, 79:1554-1557.

Qiu W H, Chen H Z. An alkali-stable enzyme with laccase activity from entophytic fungus and the enzymatic modification of alkali lignin. Bioresource Technol, 2008, 99:5480-5484.

Qiu W H, Zhang W Y, Chen H Z. Natural laccase mediators separated from water-washed solution of steam exploded corn straw by nanofiltration and organic solvent fractionation. Bioresource Technol, 2014, 156:368-371.

Camarero S, CaÑas A I, Nousiainen P, et al. p-Hydroxycinnamic acids as natural mediators for laccase oxidation of recalcitrant compounds. Environ Sci Technol, 2008, 42:6703-6709.

10.3969/j.issn.1674-0319.2015.05.004

漆酶是一种含铜多酚氧化酶，可催化氧化酚型底物，不能氧化降解非酚型结构单元，但介体的加入可实现漆酶与非酚类底物间的电子传递，实现漆酶对非酚型底物的最终氧化。文章综述漆酶介体催化常用介体及其研究进展，并针对合成介体有毒价高、天然介体提取纯化复杂的特点，提出一种新型介体——木质素降解产物中的漆酶介体。