葛根素特异性敲除技术方法分析

郭立忠朱月健

葛根素特异性敲除技术方法分析

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目的分析葛根素特异性的敲除方法。方法分析葛根素特异性敲除技术的建立，并探讨葛根素敲除技术方法的应用。结果葛根素是葛根中的异黄酮，属于植物雌激素，葛根是豆科植物野葛的根。葛根主要具有生津止渴、退热舒肌以及止泄等作用。结论葛根素在临床上能够应用于改善心律失常、扩张血管、降血压、改善微循环等，特别是在改善心脑血管等炎症疾病方面有医疗价值。

葛根素；敲除技术

1 材料准备

1.1 材料

葛根素敲除技术方法的建立主要涉及到的材料有琼脂糖凝胶4B、葛根素、葛根、甲醇、层析柱、二甲基亚砜、氢氧化钠、碳酸氢钠以及盐酸。

1.2 仪器

葛根素敲除技术方法建立所需仪器主要包括酶标仪、氮吹仪、高效液相色谱仪、数显恒流泵以及部分收集仪。

1.3 溶液

葛根素敲除技术方法建立所需配置溶液见表1。

表1 葛根素敲除技术方法所需溶液

2 葛根素敲除技术建立方法

2.1 制备免疫亲和层析柱

首先活化凝胶，取适量保存在22%乙醇中的琼脂糖凝胶，用蒸馏水对其进行反复的清洗，将乙醇洗净，在将其放置在玻璃漏斗中，水泵真空抽干。再取10 g左右过滤好的凝胶用二甲基亚砜溶液清洗，之后加入氢氧化钠、碳酸氢钠以及盐酸，待其反应完成后，用双蒸水进行反复清洗，直至清洗液中没有环氧基。其次又取适量活化凝胶，用＞5倍体积的偶联缓冲液对其进行冲洗，之后将其移入放有葛根素单抗的偶联缓冲液中，在恒温摇床中反应60 min，使其静置［1］。用滤器过滤，且用3倍柱体积偶联缓冲液进行冲洗，将冲洗下的偶联上清收集，计算其中的偶联抗体含量。接着，将与葛根素单克隆抗体充分偶联的凝胶介质悬浮在0.06%左右的硼氢化钠溶液中，将凝胶介质表面残留的环氧基团进行还原，完成还原之后，用5倍体积0.01 MPBS溶液将硼氢化钠冲洗干净［2］。最后用3倍体积的0.1 M乙酸钠缓冲液以及0.1 M Tris-Hcl缓冲液对其进行反复交替冲洗。取大小合适的玻璃层析柱装置冲洗好的凝胶，再用3倍体积平衡缓冲液冲洗凝胶，当凝胶沉降之后，标记凝胶上端，并根据层析柱内径以及凝胶的高度，将凝胶柱体积计算出来。然后将层析柱开关关闭，将其放置于4℃冰箱中储存。

2.2 建立葛根素免疫亲和层析敲除法

首先将50 g葛根饮片置于离子水中，加热沸腾0.5 h后，用纱布将其药渣过滤干净，将葛根水于室温静置。之后将葛根水按照75%的比例与乙醇反应，当其出现絮状之后放置0.5 h，用纱布过滤，将上清液取出，再置于0.22 μm的一次性滤器中过滤。接着用3倍体积的平衡缓冲液以1～2 ml/min的速度对免疫亲和层析柱进行冲洗。然后将葛根提取液用PBS稀释之后加入免疫亲和层析柱中，对样品体积、流速进行控制，保证凝胶上的单克隆抗体充分的特异性吸附。接着再用5倍体积的双蒸水对凝胶内多余的葛根素、非特异性吸附杂质冲洗干净。然后用5倍体积的洗脱缓冲液对凝胶进行冲洗，洗脱缓冲液会改变免疫亲和层析柱中的离子环境、pH值，也会改变抗体构象，单克隆抗体的特异性结合会被破坏，也就是说葛根素液被分离出了免疫亲和层析柱。最后就用3倍体积平衡缓冲液对葛根素单克隆抗体免疫亲和层析柱进行冲洗，保证免疫亲和层析柱能再利用。

3 葛根素特异性敲除术的应用

3.1 葛根素特异性敲除术的目的

由于患者心血管内皮组织出现损伤与修复之间的平衡失调，从而导致心血管疾病的发生，而葛根素其主要生物机理为对于内皮细胞Ca2+的浓度进行均衡调节，从而对心血管内皮细胞的舒张作用产生影响。葛根素特异性敲除术的主要目的在于减少内皮组织对葛根素化学成分的依赖性，使内皮血管舒张对于葛根素调节的依赖性减少，通过NO在内皮细胞舒张效应释放的同时，使得葛根素不再起主导作用，其他药物成分将对内皮血管舒张起到关键作用。另一方面，内皮血管在舒张过程中，葛根素对雌激素释放起到一定作用，而内皮血管的稳定与NO浓度有关，适量减少雌激素的释放，可以减轻内皮血管在舒张过程中所产生的剧烈程度，从而确保心血管在药物舒张时的平滑性。

3.2 葛根素的应用

葛根素是从豆科植物野葛根中提取的一种单一成份黄酮苷，具有活血化瘀、改善微循环、扩张冠状动脉和脑血管、降低心肌耗氧量等作用。葛根素注射剂临床用于治疗心脑血管疾病、视网膜血管病、眼底病及突发性耳聋等。

葛根在中药中常用于治疗心血管疾病、腹泻以及发烧。葛根中的活性成分是葛根素，其在临床上还能用于治疗心绞痛、结肠癌、糖尿病、乳腺癌、酒精性肝损伤、肝纤维化以及缺血性中风［3］。其中，治疗心血管疾病的药理机制是葛根素通过对内皮细胞进行调节，葛根中的总黄酮能增加脑及冠状动脉的血流量。

4 结语

葛根素对动物和人体的脑循环以及外周循环有促进作用。葛根总黄酮在改善高血压及冠心病患者的脑血管张力、弹性和博动性供应等方面均有温和的促进作用。葛根素不仅改善人体的正常脑微循环，而且对微循环障碍也有改善作用，主要表现为局部微血管血流和运动的幅度增加。葛根素对突发性耳聋患者的甲皱微循环也有改善作用，能加快微血管血流速度，清除血管袢淤血，提高患者的听力。葛根素对缺氧心肌具有保护作用，葛根素能降低缺血心肌的耗氧量，保护心脏免受缺血再灌注所致的超微结构损伤。

［1］许益笑，王万铁，徐正祄，等． 葛根素对缺血/再灌注损伤兔肺组织天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3变化的影响［J］． 中国中西医结合急救杂志，2008，15（2）：104-107．

［2］胡海涛，封菲，丁美萍． 葛根素协同阿司匹林治疗对急性脑梗死患者血管内皮细胞损伤标志物的影响［J］． 中国中药杂志，2008，33（23）：2827-2829．

［3］韩江全，于奎营，何敏，等． 葛根素对大鼠脑缺血再灌注侧皮质区细胞凋亡及p-Akt（Ser473）表达的影响［J］． 中国中西医结合杂志，2012，32（8）：1069-1072．

Analysis of Puerarin Specific Knockout Technology

Guo Lizhong1ZHU Yuejian21 The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130021，China，2 Anhui Jiren Pharmaceutical CO．LTD，Bozhou 236800，China

ObjectiveTo analyze the puerarin prime specific knockout method．MethodsThe establishment and discussion of the specific knockout technology of puerarin and the application of the method of puerarin knockout．ResultsPuerarin was pueraria isoflavones belonging to phytoestrogens． Pueraria was the root of leguminous plants． The main effect had thirst，fever and diarrhea and other effects．ConclusionPuerarin can improve cardiac arrhythmia，expand blood vessels，reduce blood pressure，improve microcirculation，especially in the improvement of cerebrovascular diseases．

Puerarin，Knock out technique

R246．6

B

1674-9316（2015）27-0116-02

10．3969/j．issn．1674-9316．2015．27．086

1 130021 长春中医药大学附属医院；2 236800亳州，安徽济人药业有限公司