电刺激干预腓肠肌拉伤后成肌调节因子MyoD与Myogenin蛋白表达的研究

电刺激干预腓肠肌拉伤后成肌调节因子MyoD与Myogenin蛋白表达的研究

刘敏

(广州体育学院，广东 广州510000)

摘要：目的：采用低强度电刺激治疗腓肠肌拉伤，观察其对于肌肉损伤部位成肌调节因子MyoD与Myogenin蛋白表达的影响。方法：雄性SD大鼠32只，随机分为对照组、模型组、D14组和D14-40Hz组。除对照组外其余各组建立腓肠肌拉伤动物模型。于造模后第5天D14-40Hz组开始予以电刺激，其余组继续喂养。正常对照组在实验开始当天，模型组在造模当天，D14组和D14-40Hz组在第14天进行在体力矩测试，测试结束后处死动物，分离腓肠肌采用免疫印迹法(Western blotting)测定MyoD与Myogenin蛋白表达。结果：对照组关节最大等长力矩值为0.236±0.045(Nm)，模型组肌肉拉伤后即刻关节最大等长力矩下降为0.176±0.034(Nm)，两者比较存在显著性差异(P<0.05)；第14天D14-40Hz组最大等长力矩值为0.247±0.038(Nm)，与D14组比较存在显著性差异(P<0.05)。MyoD与Myogenin蛋白表达测定结果：肌肉拉伤后第14天MyoD蛋白表达D14组与对照组比较无差异(P>0.05)，但是MyoD蛋白表达D14-40Hz组比D14组增强明显(P<0.05)；肌肉拉伤后第14天，D14-40Hz组Myogenin蛋白表达明显强于D14组(P<0.05)。结论：腓肠肌急性拉伤后，早期采用低强度电刺激治疗可以明显提高关节力矩，并促进了MyoD与Myogenin的表达，对组织修复起到了积极地作用。

关键词：腓肠肌拉伤;电刺激治疗

中图分类号：G804.2

收稿日期：2015-06-23

作者简介：刘敏(1974-),女，贵州人，讲师

研究方向：健美操训练与教学

Effect of Electrical Therapy on Protein Expression of MyoD

and Myogenin in Gastrocnemius Strain

LIU Jun

(Guangdong University of Foreign Studies, Guangzhou 510006,China)

Abstract：Objective：To observe the effect of electrical therapy on protein expression of MyoD and Myogenin in gastrocnemius strain. Methods：Thirty-two male Sprague-Dawley (SD) rats were utilized in this study(control group, animal model group, D14 group, and D14-40Hz group). All male SD rats except those in control group were created a partial gastrocnemius stretch injury. After injury, no interventions were given to animal model group and D14 group. At fifth day, the electrical protocol was given to D14-40Hz group. After experiment, changes in joint torque, protein expression of MyoD and Myogenin were tested. Results: The isometric ankle peak torque of control group was 0.236±0.045Nm. The isometric peak torque of animal model group dropped to 0.176±0.034Nm(P<0.05)post-injury. The isometric ankle peak torque of D14-40Hz group was 0.247±0.038., which is significant difference compared to the isometric peak torque of D14 group(P<0.05). No significant difference of the protein expression of MyoD existed between control group and D14 group(P>0.05). However, the protein expression of MyoD in D14-40Hz group was higher than D14 group (P<0.05). The protein expression of Myogenin (D14-40Hz) was higher than D14 group(P<0.05).Conclusions: The low intensity 40Hz electrical stimulation could increase the isometric peak toque. What's more, it was helpful to improve the expression of MyoD and Myogenin. Therefore, it showed the 40Hz electrical stimulation was useful for muscular rebuilding of gastrocnemius strain by improving gene regulatory of MyoD and Myogenin.

Key words：Gastrocnemius Strain, Electrical Therapy

现代竞技运动中肌肉损伤是最常见的运动损伤之一[1-6],轻度的肌肉拉伤可影响运动员的训练、比赛等，严重的肌肉拉伤断裂则可迫使运动员结束其运动生涯。因此，运动中肌肉拉伤临床治疗越来越受到关注。其中电刺激在肌肉损伤临床治疗中的应用越来越受到关注，目前虽然无法明确地阐述电刺激对于肌肉拉伤康复治疗的作用机制，但是临床实践中却不断证实了它的有效性[7-9]。本文拟采用低强度电刺激治疗腓肠肌急性拉伤，观察分析其对于肌肉损伤部位结构重塑以及成肌调节因子MyoD与Myogenin蛋白表达的影响的影响，从而为临床治疗提供实验支持和理论依据。

1实验材料与方法

1.1实验动物分组与动物模型构建

雄性SD大鼠32只，体重340±20g。先按照动物体重分层，然后再随机分为对照组、D0模型组、D14模型组和D14-40Hz组。模型组与D14-40Hz组建立腓肠肌拉伤动物模型。采用腹腔注射方法麻醉大鼠，然后大鼠取仰卧位予以固定，再选大鼠一侧肢体，用生理刺激仪的针电刺激肌肉两端使固定侧肢体的腓肠肌发生强直收缩，与此同时发动机带动大鼠固定板腓肠肌迅速做离心收缩，造成一侧肢体腓肠肌拉伤。

1.2电刺激治疗方案

D14-40Hz组于动物造模后第6天开始给予电刺激，实验前清理大鼠皮肤，将表面电极贴放在腓肠肌远近两端。电刺激方案为：频率40Hz，脉冲宽度200us，间隔为5s开10s关，24h内两次，每次持续30min，相隔3h，刺激强度以能够观察到肉眼可见腓肠肌肌肉收缩为度。

1.3实验指标测试

1.3.1在体力矩的测定

对照组、模型组、D14组和D14-40Hz组分别于实验当天、第14天测试关节力矩，麻醉后将大鼠取仰卧位固定，腿部固定板与动态扭矩传感器一端连接，另一端与发动机轴连接，实验中通过运动控制器调整角度为900，使用针电刺激使腓肠肌发生强直收缩，大鼠足部发生跖曲，从而通过扭矩传感器测量力矩大小。

1.3.2MyoD与Myogenin蛋白表达免疫印迹测定

实验结束后分离腓肠肌组织，并离心提取总蛋白测定肌肉组织中的蛋白含量。常规上样电泳，转膜(冰上电泳,电泳2 h,电流80V)，将转印好的PVDF 膜放入封闭液中于脱色摇床上摇动2h。然后漂洗, 再加入MyoD/Myogenin一抗抗体, 4℃下孵育过夜。第二天漂洗5次，然后予以二抗稀释液与膜接触，室温下孵育2h。最后在暗室中显影和定影。

1.4统计学分析

2实验结果

2.1在体力矩测量结果

2.1.1大鼠肌肉拉伤后不同时刻最大等长力矩指标的变化

对照组腓肠肌力矩值为0.236±0.045(Nm)，模型组在肌肉拉伤后即刻最大等长力矩下降为0.176±0.034(Nm)，两者比较存在显著性差异(P<0.05)；第14天基本恢复到正常水平，D14组腓肠肌力矩值为0.227±0.036(Nm)，与对照组比较差异不显著性(P>0.05)。见表1：

表1　实验各组最大等长力矩测量结果

注：与对照比较：*P<0.05；与模型组比较：△P<0.05

2.1.2大鼠肌肉拉伤后第14天各组最大等长力矩指标的变化

第14天D14-40Hz组最大等长力矩值为0.247±0.038(Nm)，与D14比较存在显著性差异(P<0.05)。见表2：

表2　实验各组最大等长力矩测量结果

注：与D14组比较：*P<0.05；与对照组比较：△P>0.05

2.2免疫印迹测定MyoD与Myogenin蛋白表达

实验第14天免疫印迹测定MyoD与Myogenin蛋白表达， D14组与对照组比较无差异(P>0.05)；与对照组比较，D14-40Hz组显著增强(P<0.05)，见图1；Myogenin蛋白表达，D14-40Hz组高于D14组(P<0.05)。见图2：

3分析与讨论

3.1电刺激对于损伤肌肉组织和修复力学指标的影响

电刺激在增加肌肉力量和肌肉损伤的治疗等方面被认为是一种有效手段，目前虽然电刺激治疗在组织修复中广泛应用，但是对于肌肉拉伤早期进行电刺激的具体时间依旧存在争议。有学者认为骨骼肌急性损伤后，早期物理电刺激治疗应该在急性炎症反应期后，因为这个时期受伤的组织表现为出血、肿胀和坏死，以及损伤组织周围有大量炎细胞聚集和浸润，一般在伤后48h～72h之间达到高峰，随后才逐渐消退。虽然关于进行电刺激治疗的具体时间存在争议，不过每一次的电刺激都会引起肌肉节律性的收缩，研究证实电刺激疗法能促进肌肉损伤后的修复，组织切片显示电刺激治疗组肌节清晰，新生的肌纤维更加成熟[10-11]。对于组织功能的评估方面，力矩是肌肉功能评价比较常用的指标[12-14]，本实验同样选用力矩测试作为组织修复的力学观测指标。电刺激[15]可以控制肌肉的收缩时间和收缩强度, 通过肌肉的收缩显著提高肌肉力量。因此，本实验假设早期(伤后第5天)给予低强度电刺激干预腓肠肌拉伤的组织修复，一方面可以避免炎症反应的加剧，另外一方面也有助于损伤组织的修复和功能重塑。本实验所采用的低强度40Hz电刺激是低频电刺激，第14天D14-40Hz组最大等长力矩值为0.247±0.038(Nm)，与D14组比较存在显著性差异(P<0.05)。这说明肌肉损伤早期低强度低频率40Hz电刺激，能够提高最大等长力矩，有利于损伤有利于损伤部位结构和功能的重塑。因此，本实验结果可以作为临床治疗的实验依据。

图1　第14天免疫印迹测定MyoD蛋白表达

图2　第14天免疫印迹测定Myogenin蛋白表达

3.2电刺激对于损伤肌肉成肌调节因子MyoD和Myogenin的影响

骨骼肌对于机械刺激有很好的反应能力，有研究表明损伤后轻微的张力刺激能够使新生的肌原纤维排列有序，并顺着刺激所产生的应力线方向排列，这对于损伤肌肉组织的重塑是非常有利的。肌肉组织如果受到诸如牵拉的机械刺激，肌肉组织内的卫星细胞则出现增值[16]，而在肌肉组织修复过程中已经证实了肌卫星细胞的重要性[17-19]。而MyoD和Myogenin在特异肌基因转录调控中起着至关重要的作用，并积极地促进了其他类型细胞转化为成肌细胞以及成肌细胞分化为肌管。同时研究也已经发现电刺激可以调节内源性各种生长因子的表达[20]，并且能够降低TGF-β的表达，据推测这可能与myogenin的作用相关[21]。而如果给予一定的牵拉刺激，可以增加肌肉组织中蛋白的合成，这其中MyoD在肌卫星细胞激活成为具有成肌特性的肌肉干细胞过程中至关重要，而蛋白myogenin则决定了肌肉干细胞能否终末分化为肌纤维[22]。本实验研究通过免疫印迹法对MyoD与Myogenin表达的测定，结果显示40Hz的低强度电刺激对于MyoD与Myogenin的表达起到促进作用，这对于新生肌纤维的结构重塑意义重大。

因此我们可以得到这样的结论，腓肠肌急性拉伤后早期采用低强度电刺激治疗，可以有效地促进损伤后尝试着从成肌调节因子MyoD与Myogenin蛋白表达，对于损伤后肌肉组织功能结构的重塑非常有利。但是，目前的研究工作还远远不足。本实验研究只是针对肌肉拉伤给予小强度的电刺激治疗，尝试着从成肌调节因子MyoD与Myogenin表达的角度解释电刺激修复损伤肌肉的机制，至于发挥该作用的其它途径尚不清楚，并且电刺激不同强度的应用疗效如何依旧有待进一步的分析和探讨。

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