处理高浓度DDNP废水的白腐真菌培养基的优化研究

王明龙

（山西清泽阳光环保科技有限公司，山西 太原 030012）

白腐真菌（white rot fungus）是一类腐生的丝状真菌，由于其分泌的胞外木质素降解酶具有非特异性和无需底物诱导的独特性能，使得它对许多结构不同、高毒性、高分子难降解有机物具有广谱的降解能力，能降解包括多环芳烃化合物、氯代芳烃化合物、农药、染料以及炸药废水等在内的多种环境污染物，在很多方面具有重要的应用价值［1-4］。同时，固定化细胞技术在废水处理中有处理效率高、稳定性强、生物密度高、反应启动快、抗逆性强、耐毒性、耐高负荷、产污泥量少、固液分离简单、菌体可循环利用等优点。因此，将两者优点结合起来的固定化白腐真菌培养及降解技术在环境保护领域更具生产实践意义［5］。

近年来，固定化白腐真菌培养及降解技术越来越多地受到世界各国科学界及工业界的高度重视，它们在环境保护领域正显示出诱人的应用前景。因此，对白腐真菌的深入研究有着重要的理论价值和实际意义，并且已成为世界各国环境保护领域又一新的研究热点［6-8］。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

本实验所用的白腐真菌是从生物研究所购买。

培养基所需试剂：葡萄糖、酒石酸铵、维生素B1、KH2PO4、NaHPO4、MgSO4、CaCl2、FeSO4、MnSO4、ZnSO4·7H2O、NaCl、牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉。

调节pH的试剂：4%的盐酸溶液，5%的氢氧化钠溶液。

1.2 仪器设备

AL204-1C（万分之一）电子分析天平；无菌接种操作室和接种环；手提式蒸汽消毒器，YXQ-LS-SII大型台式灭菌锅；电动离心机；AL204-1C（千分之一）电子分析天平；柜式培养箱；SPX-150-D振荡培养箱。

1.3 培养基

1）白腐真菌的固体培养基：葡萄糖10g，琼脂15g～20g，酒石酸铵 0.4g，KH2PO43g，NaHPO40.2g，MgSO40.25g，维生素B1 0.005g，CaCl20.1g，FeSO40.1g，ZnSO4·7H2O 0.03g，MnSO40.002g。

2）白腐真菌的液体培养基（摇床发酵液体培养基）：葡萄糖10g，酒石酸铵0.4g，KH2PO43g，NaHPO40.2g，MgSO40.25g，维生素B1 0.005g，CaCl20.1g，FeSO40.1g，ZnSO4·7H2O 0.03g，MnSO40.002g。

1.4 培养方法

1.4.1 培养基的制备

1）按照固体和液体的培养基成分用万分之一分析天平称好药品，倒入烧杯中，并用蒸馏水定容到标线。

2）用盐酸或者氢氧化钠调节溶液的pH值，采用pH试纸来判断pH值。

3）将用来制备固体培养基的培养皿用报纸包好和培养液放入台式蒸汽锅中，在115℃下杀菌20min。将用来制备液体培养基的含有培养液的烧杯放入蒸汽消毒器，在121℃下杀菌20min。

4）固体培养基：消毒后，将培养液趁热倒入培养皿中，放置在无菌环境中备用。

5）液体培养基：待冷却后倒入培养瓶，放在无菌环境中待用，等温度降到30℃再接种［9-13］。

1.4.2 微生物生长量的测量方法

本实验中在测量白腐真菌时采用了直接测量的方法，通过测其湿重来判断它在该培养基中的生长量。具体测法：用分析天平（千分之一）测量4个离心瓶的质量。将培养好的白腐真菌液体培养液分组，每4个1组。每次测4个，每2个用托盘天平配平。放入离心机中，设定好转速和时间（4 000r/min，20min），开始离心。离心后，将上清液倒掉，用分析天平（千分之一）测量其质量，并记录。

2 结果与讨论

本实验的液体培养基为白色悬浮液，经过48h的培养，白腐真菌逐渐成型，出现部分孢体。而经过96h的培养，菌液中出现孢子状菌体，菌体比较舒展，可用肉眼观察其长势。

在本实验中采用葡萄糖的最佳质量浓度为10g/L，选取转速为120r/min，ZnSO4最佳质量浓度是 0.03g/L，MnSO4的 最 佳 质 量 浓 度 为0.001 7g/L［14］。

2.1 各单因素对白腐真菌生长量的影响

2.1.1 pH值对生长量的影响

白腐真菌的最佳培养温度为30℃～40℃。查阅资料可以发现，在这个温度段，温度对菌体的影响不是很大，所以选择的温度为37℃。将pH值分成6个水平分别进行实验。经过培养和测试，得出表1的结论。白腐真菌在酸性环境中生长较好，碱性环境抑制该菌的生长；但过量的酸性也会抑制白腐真菌的生长。白腐真菌的最适生长pH值为4.5。

表1 pH值与生长量的关系

2.1.2 酒石酸铵质量浓度对生长量的影响

温度为37℃，将液体培养基中的酒石酸铵分成6个质量浓度梯度进行实验。经过培养和测定，得出表2的结论。酒石酸铵是培养基中的氮源，没有酒石酸铵，白腐真菌的生长效果很不好。但是，随着酒石酸铵质量浓度的增加，白腐真菌的生长量出现了一个峰值；过了峰值，生长量又随着浓度的增加而减小。所以，酒石酸铵的最佳质量浓度为0.6g/L。

表2 酒石酸铵质量浓度与生长量的关系

2.1.3 磷酸二氢钾质量浓度对白腐真菌的影响

温度为37℃，将培养基中的磷酸二氢钾的质量浓度分成6个水平进行实验。经过培养和测定，得出表3的结论。起初，白腐真菌的生长量随着磷酸二氢钾质量浓度的增加而增加，在质量浓度为4g/L时生长量最大；过了最大值，生长量随着质量浓度的增加而减小。所以，磷酸二氢钾的最佳质量浓度为4g/L。

表3 磷酸二氢钾质量浓度与生长量的关系

2.1.4 磷酸一氢钠质量浓度对生长量的影响

室温为37℃，将培养基中的磷酸一氢钠的质量浓度分成6个水平，将等量的白腐真菌接种在6个培养基中。经过培养和测定，得出表4的结论。随着磷酸一氢钠质量浓度的增加，白腐真菌的生长量增加，在0.2g/L时得到最大值；随后，随着质量浓度的增加，生长量减少。所以，磷酸一氢钠的最佳质量浓度为0.2g/L。

表4 磷酸一氢钠质量浓度与生长量的关系

2.1.5 硫酸镁质量浓度对白腐真菌生长量的影响

室温为37℃，将培养基中的硫酸镁分成6个水平进行实验，得出表5的结论。最佳硫酸镁的质量浓度为0.4g/L。但是，硫酸镁对白腐真菌的生长影响不是特别明显，还有待进一步研究，所以不对其进行正交化。

表5 硫酸镁质量浓度与生长量的关系

2.1.6 氯化钙质量浓度对生长量的影响

室温为37℃，将培养基中的氯化钙分成6个水平进行实验。经过培养和测定，得出表6的结论。随着氯化钙质量浓度的增加，白腐真菌的生长量减少。所以，氯化钙对白腐真菌有一定的抑制作用，对白腐真菌的生长不利。

表6 氯化钙质量浓度与生长量的关系

2.2 正交实验

2.1 实验探讨了各单因素（pH、酒石酸铵、磷酸二氢钾、磷酸一氢钠、硫酸镁、氯化钙）对白腐真菌生长量的影响，初步确定了单个实验条件值，它只能反映单个实验因素作用下白腐真菌生长量的变化趋势。因此，为了探讨在各因素综合作用下白腐真菌处理高浓度DDNP废水的最佳培养基条件，本实验以葡萄糖（A）为碳源，磷酸二氢钾（B）、磷酸一氢钠（C）为磷源，酒石酸铵（D）为氮源，采取4因素3水平（见表7）正交实验的方法对白腐真菌液体培养基进行优化。正交实验结果见表8。

表7 L9（34）正交实验因素和水平

表8 L9（34）正交实验结果分析

按照正交实验表8配出9个培养基，分别接种相同量的菌体，培养5d后，称量菌体的湿重，并记录。通过表8可以看出，4号瓶的生长量最大。所以，最佳配比即为 A2B1C2D3，即葡萄糖10g/L，酒石酸铵0.7g/L，磷酸一氢钠0.2g/L，磷酸二氢钾1g/L。

3 结论

对有效处理高浓度DDNP废水的白腐真菌培养基的优化实验研究可知，pH、酒石酸铵、磷酸二氢钾、磷酸一氢钠、硫酸镁、氯化钙对白腐真菌培养基中的生长量皆有影响；最佳的碳源、氮源和磷源为葡萄糖、酒石酸铵和磷酸二氢钾及磷酸一氢钠；白腐真菌培养基优化的最佳配比为：葡萄糖10g/L，酒石酸铵0.7g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸一氢钠0.2g/L，硫酸镁0.4g/L，VB1 0.005g/L，硫酸亚铁0.1g/L，硫酸锌0.03g/L，硫酸锰0.005g/L。

利用白腐真菌处理高浓度DDNP废水具有明显的经济效益和社会效益，在工业中已经利用白腐真菌来处理高浓度DDNP废水。结果显示，它不仅能降解硝基苯，还能降解硝基苯的次级代谢产物，说明白腐真菌可以完全降解硝基苯［15-20］。因此，对白腐真菌培养基的优化研究更有重大的实际意义，可以使其在工业水处理中有着更广阔的应用前景。

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