拉米夫定与IFNα-2b序贯治疗对肝癌细胞HBsAg、HBeAg表达及细胞增殖的影响

丁扬，杨伟，李婧，潘晓，王雪(潍坊医学院，山东潍坊6000;中国人民解放军第89医院)

拉米夫定与IFNα-2b序贯治疗对肝癌细胞HBsAg、HBeAg表达及细胞增殖的影响

丁扬1，杨伟2，李婧2，潘晓1，王雪1
(1潍坊医学院，山东潍坊261000;2中国人民解放军第89医院)

摘要:目的探讨拉米夫定与干扰素(IFN)α-2b序贯治疗对肝癌HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeAg表达及细胞增殖的影响。方法取对数生长期HepG2.2.15细胞，分为对照组、Lam组、IFN组、联合组和序贯组。对照组不加药常规培养; Lam组加入5 μg/mL拉米夫定200 μL，IFN组加入10 000 IU/mL IFNα-2b 200 μL，联合组将拉米夫定、IFNα-2b混合后加入，均培养6d;序贯组先加拉米夫定培养3d，再加IFNα-2b培养3d。采用ELISA法检测各组HBsAg、HBeAg表达情况，MTT法检测各组细胞增殖情况。结果实验结束后Lam组、IFN组、联合组、序贯组的HBsAg、HBeAg表达量均低于对照组，P均＜0.05。序贯组HBsAg、HBeAg表达量均低于Lam组、IFN组、联合组，P均＜0.05。对照组、Lam组、IFN组、联合组、序贯组OD值分别为1.16±0.07、1.08±0.04、0.59±0.31、0.50± 0.03、1.09±0.04，IFN组与联合组OD值明显低于对照组、Lam组、序贯组，P均＜0.05。其余各组两两比较，P＞0.05。结论拉米夫定与IFNα-2b序贯应用可以抑制HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeAg表达，降低IFNα-2b对肝癌细胞增殖的抑制作用，提示序贯治疗安全、可行。

关键词:拉米夫定;干扰素;序贯疗法;肝肿瘤;细胞增殖

拉米夫定、干扰素(IFN)抗HBV效果确切，但能否序贯应用仍存在争议。有学者认为，序贯抗HBV治疗可引起耐药［1，2］;也有学者认为，序贯抗HBV治疗可有效控制HBV数量，改善患者的生活质量［3］。2014年9～10月，我们观察了拉米夫定、IFNα-2b序贯抗HBV治疗对体外培养的肝癌HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeAg抗原表达及细胞增殖的影响。现报告如下。

1　材料与方法

1.1材料人肝癌HepG2.2.15细胞株购于上海瑞鹿生物科技有限公司。取拉米夫定片(福建广生堂股份有限公司)0.2 g研磨成粉，加入PBS 20mL配制成拉米夫定母液，4℃保存，实验中稀释至5 μg/mL。将重组人IFNα-2b注射液(天津华利达生物有限公司)300万IU用蒸馏水稀释至10 000 IU/mL。MTT试剂盒购于北京Solarbio科学技术有限公司，HBsAg与HBeAg检测试剂盒购于北京生物技术研究所。

1.2细胞分组及干预将HepG2.2.15细胞迅速水浴后，加入含有细胞培养液的离心管中，离心弃上清，将细胞悬液置于5mL细胞培养基中，放入细胞培养箱。待细胞长成单层后，用0.25%的胰酶消化，每1周传代1次。取对数生长期细胞接种于96孔板培养24 h，设对照组、Lam组、IFN组、联合组和序贯组各5孔。对照组不加药常规培养，Lam组加入拉米夫定200 μL，IFN组加入IFNα-2b 200 μL，联合组将拉米夫定、IFNα-2b各200 μL混合后加入，均培养6d;序贯组先加拉米夫定200 μL培养3d，再加IFNα-2b 200 μL培养3d。

1.3 HBsAg、HBeAg表达检测采用ELISA法。所有操作均严格按试剂盒说明书进行，于波长450 nm处用酶标仪读取各孔吸光度(OD)值。以空白培养液为阴性对照。

1.4细胞增殖情况检测采用MTT法。吸取各组培养孔内液体200 μL，加入新鲜培养液90 μL，再加入MTT液110 μL继续培养4 h。取上清，每孔加入Formazan溶解液110 μL，低速振荡10min，使结晶充分溶解。于波长490 nm处用酶标仪读取各孔OD值。

1.5统计学方法采用SPSS17.0统计软件。计量资料以x珋±s表示，组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组HBsAg、HBeAg表达比较见表1。

表1　各组HBsAg、HBeAg表达比较()

表1　各组HBsAg、HBeAg表达比较()

注:与对照组相比，*P＜0.05;与Lam组、IFN组、联合组相比，#P＜0.05。

组别　n HBsAg　HBeAg对照组5　3.38±0.21　3.32±0.54 Lam组　5　2.87±0.31*　2.89±0.29*IFN组　5　2.40±0.17*　2.53±0.26*联合组　5　2.46±0.41*　2.50±0.71*序贯组　5　2.08±0.33* #　2.37±0.13*#

2.2各组细胞增殖情况比较对照组、Lam组、IFN组、联合组、序贯组的OD值分别为1.16±0.07、1.08±0.04、0.59±0.31、0.50±0.03、1.09±0.04，对照组、Lam组、序贯组OD值相比差异无统计学意义，IFN组与联合组OD值相比差异无统计学意义，但明显低于其余三组，P均＜0.05。

3　讨论

肝癌HepG2.2.15细胞株是由两个头尾相连的

HBV-DNA全基因重组质粒沾染受体细胞HepG2而获得的，可在体外增殖，在细胞培养上清中分泌HBsAg、HBeAg和完整的HBV大球形颗粒，同时还能产生大量的复制中间体，是目前各实验室广泛用于筛选和评价体外抗HBV药物良好的实验模型［4］。

拉米夫定是核苷酸类似物中的代表性药物，能阻止HBV在肝细胞内逆转录过程中DNA链的延伸，使病毒停止扩增。但拉米夫定对HBV环DNA无直接清除作用［5］，只有长期使用才能维持病毒低表达水平，易诱导病毒产生耐药变异，导致用药期间病毒反跳。IFNα-2b是一种多功能免疫调节因子，可诱导细胞产生抗病毒蛋白，具有特殊的抗病毒作用。其抗HBV的机制可能涉及以下方面:①通过细胞内信号转导途径，激活细胞内相关酶，直接降解HBV的DNA或mRNA，介导NK、NKT、CTL等免疫细胞吞噬HBV感染的肝细胞;②诱导感染HBV的肝细胞死亡;③刺激巨噬细胞吞噬HBV颗粒等［6］。体外实验证实，拉米夫定、IFNα-2b序贯治疗对HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeAg表达的抑制作用强于二者单独或联合应用［7］。其可能机制是由于拉米夫定在HepG2.2.15细胞内磷酸化，在HBV复制过程中磷酸化的拉米夫定与dCTP竞争起到抗病毒作用，拉米夫定协同IFNα-2b可通过诱导2'-5'寡聚腺苷酸合成酶降解HBV RNA，进而导致HBsAg、HBeAg表达下调。

IFNα-2b单独应用细胞毒性较强。本研究显示，IFNα-2b对HepG2.2.15细胞增殖的抑制作用强于拉米夫定，但两者联合以及序贯应用时，拉米夫定可以减轻IFNα-2b对细胞增殖的抑制作用。IFNα-2b对不表达HBV的HepG2细胞无细胞增殖抑制作用，而对HepG2.2.15细胞有明显的致细胞凋亡作用［8］。其主要原因在于IFNα-2b对HepG2.2.15细胞增殖的抑制作用与HBV的表达呈正相关［9，10］，因此IFNα-2b很难单独作为抗病毒药物在临床上应用。

综上所述，在拉米夫定和IFNα-2b序贯治疗中，拉米夫定可抑制HepG2.2.15细胞HBV复制，降低IFNα-2b的细胞增殖抑制作用。

参考文献:

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［3］田群，左维泽，曹玉文，等.拉米夫定与IFNα-1b序贯治疗HBeAg阳性慢性乙肝患者临床疗效观察［J］.现代生物医学进展，2011，19(11): 3694-3695.

［4］徐艳玲，刘令九，侯丽娟，等.干扰素α-2b与白细胞介素-2联合作用对体外HepG2.2.15细胞增殖及乙肝病毒复制的影响［J］.中国生物制品杂志，2013，26(7): 970.

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［10］Reifenberg K，Hildt E，Lecher B，et al.IFN gama expression inhibits LHBs storagedisease and ground glass hepatocyte appearance，but exacerbates inflammation and apoptosis in HBV surface protein-accumuLating transgentic livers［J］.Liver Int，2006，26(8): 986-963.

收稿日期:( 2014-10-31)

文章编号:1002-266X(2015)34-0022-02

文献标志码:A

中图分类号:R735.7

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.34.008