一株黄河三角洲盐碱地耐盐菌的分离、鉴定及耐盐能力分析

陆洪省,徐莹莹,于梦梦，张庆莹，王建燕，谭好臣

(山东科技大学 化学与环境工程学院,山东 青岛　266590)



一株黄河三角洲盐碱地耐盐菌的分离、鉴定及耐盐能力分析

陆洪省,徐莹莹,于梦梦，张庆莹，王建燕，谭好臣

(山东科技大学 化学与环境工程学院,山东 青岛266590)

摘要:从黄河三角洲盐碱地土壤分离到一株耐高盐菌株NM-1.对该菌株生理生化性质、耐盐性以及系统分类位置进行了分析.结果表明:菌株NM-1为长杆状,革兰氏阴性,菌落黄色,呈圆形,湿润、光滑.能利用葡萄糖、乳糖和蔗糖,不能利用淀粉和明胶.生长pH范围为8.0～10.0,最高耐盐浓度(NaCl)为30%,为中度嗜盐微生物,最适生长的Na2CO3浓度为0.25 M.16S rDNA 序列分析表明:该菌株与Halomonas variabilis (JN645866)以及Halomonas variabilis (AY204638)序列的相似性均为98%,结合其形态、生理生化性质,认定该菌株属于耐盐单胞菌属,暂命名为Halomonas sp. NM-1(AB917466).

关键词:盐碱地;盐单胞菌;分离鉴定

我国北方如黄河三角洲以及内蒙古等地广泛分布着大面积的盐碱地,在这些高盐环境中生长的微生物群体由于长期适应环境,逐渐形成了极为特殊的耐盐机制,具有很高的研究和利用价值.

目前,已发现的中度嗜盐菌多为盐单胞菌属(Halomonas) 的革兰氏阴性菌、好气杆菌[1-3].该属是1980 年Vreeland 等[4]鉴定出伸长盐单胞菌(Halomonaselongate) 时首次提出的.也有其他科的好氧或兼性厌氧菌,包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、产甲烷菌和严格厌氧细菌.耐盐单胞菌是一类能在绝对盐度(NaCl) 为0%～ 32%条件下生长的耐盐细菌.目前报道的盐单胞菌属细菌都生长在高盐环境,如盐场和盐湖[5]、盐水湿地[6]、盐渍土[7]、海水[8]、海生生物[9]、深海热液喷口[10]、盐碱地[11].

作者从黄河三角洲盐碱地土壤中分离一株高耐盐菌,对其形态、生理生化性质、耐盐能力以及16S rDNA基因序列进行了解析,以期为开发和利用耐盐菌种资源奠定一定的理论基础.

1材料与方法

1.1试样及培养基

土壤样品采集于黄河三角洲盐碱地,共选取11个采样点,将各点表层(3～30 cm)土壤采集后混匀,立即装入灭菌的密封袋中,土样带回实验室后立即对菌进行富集和分离.剩余样品储存于4 ℃冰箱中待用.

富集培养基成分: (NH4)2SO41 g,K2HPO47 g, KH2PO43 g, MgSO4·7H2O 0.1 g, 葡萄糖10 g, 蒸馏水1 000 mL.分离培养基成分:酵母膏 10 g,蛋白胨7.5 g,柠檬酸钠3.0 g,KCl 2.0 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,FeSO4·7H2O 0.036 g,NaCl 20.0 g,Na2CO310.0 g,蒸馏水1 000 mL,pH用盐酸或氢氧化钠调节.富集培养基及分离培养基均在121 ℃灭菌20 min 后使用,制备固体平板培养基时加入15 g·L-1琼脂,制备半固体培养基时加入2 g·L-1琼脂.

1.2耐盐细菌的富集、分离和筛选

称量5 g土样加入盛有45 mL无菌水的烧杯中,搅拌,使土壤溶解,静置20 min,取土壤浸出液10 mL加入盛有200 mL已灭菌的富集培养基中,恒温振荡培养6 d(130 r·min-1,30 ℃),取3 mL上述培养液转接到新鲜的富集培养基中,重复培养3次,培养条件同上,得到耐盐碱细菌富集液.

1.3生理生化性质测定

对上述纯化得到的单菌落用耐盐菌富集液体培养基进行富集培养,得到富集培养液,对其生理生化性质进行测定,测定指标包括革兰氏染色、MR实验、V.P实验、明胶水解实验、淀粉水解实验、糖发酵实验、H2O2酶测定,操作方法见参考文献[1].

1.4不同pH对耐盐碱菌生长的影响

所用培养基为富集培养基.用NaOH调整培养基pH分别为8、9、10、11和12.分装150 mL于250 mL三角瓶中,121 ℃灭菌20 min,冷却,然后接种1.5 mL富集培养液(109cfu·mL-1).培养条件为恒温振荡培养(130 r·min-1,30 ℃),每隔24 h定期取培养液,测定其吸光度(OD),波长采用560 nm,平行测定3个重复.

1.5不同NaCl浓度对菌生长的影响

向富集培养基中加入NaCl,分别配制成含10%、20%和30%的NaCl溶液,调整pH为9.0,接种、培养以及吸光度测定均同1.4,平行测定3个重复.

1.6不同Na2CO3浓度对菌株生长的影响

向富集培养基中加入不同质量的Na2CO3,使Na2CO3浓度分别为0、0.2、0.25、0.3 M,121 ℃灭菌20 min,接种富集培养液并定期测定菌液吸光度OD560,培养条件及测定方法同1.4,平行做3个重复.

1.7耐盐菌DNA的提取、PCR反应及系统树的创建

1.7.1细菌DNA提取

采用UNIQ-10柱式细菌基因组抽提试剂盒(上海生物工程有限公司)对菌株进行DNA提取,提取步骤按照试剂盒说明书进行.

1.7.2引物

采用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增,引物序列:7F:5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3';1 540R:5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'.

1.7.3PCR反应条件

1.7.4系统发育树的创建及分类学位置的确定

利用DDBJ (DNA Data Bank of Japan, http://www.ddbj.nig.ac.jp/)数据库,把分离菌株测得的16S rDNA序列进行序列比较,与相似度高的16S rDNA序列创建系统发育树,所用软件为CustalX2.1和Mega5 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis),系统进化距离矩阵根据Kimura模型估算[12],创建方法为邻接法(Neighbor-Joining)[13-15].

2实验结果与讨论

2.1耐盐菌生理生化性质

菌株NM-1为长杆状,革兰氏阴性,在耐盐碱分离培养基上,菌落呈圆形、湿润、光滑,菌落为黄色,可利用葡萄糖、乳糖和蔗糖,氧化酶以及过氧化氢酶阳性,理化性质见表1.

表1　菌株NM-1生理生化性质

注：“+”为阳性;“-”为阴性

2.2不同pH对菌株生长的影响

在不同pH(8.0、9.0、10.0、11.0、12.0)条件下, 利用耐盐菌富集培养基对菌株NM-1进行培养,每隔24 h测定培养液吸光度,绘制成时间-吸光度曲线,结果如图1所示.

由图1可以看出,在pH 为8.0、9.0 和10.0条件下,菌株NM-1的最大吸光度接近,分别为0.76、0.74和0.64,远远高于pH 为11.0和12.0 条件下的吸光度,因此,菌株NM-1的最适pH生长范围为8.0～10.0.

2.3不同NaCl浓度对菌株生长的影响

将菌株NM-1在含有10%、30%和50% NaCl的富集培养基中培养,每隔24 h测定其吸光度OD560,绘制生长曲线如图2所示.

由图2可以看出,菌株NM-1在NaCl浓度为10% 和30%条件下,均在培养4 d时吸光度达到最大值,分别为0.98和0.96.而4 d后,菌株NM-1在NaCl浓度为30%条件下的吸光度明显下降至0.75.而在NaCl浓度为50%的培养条件下,菌株NM-1的生长停滞期明显延长,吸光度变化很小,且培养3 d时出现最大吸光度.因此,该菌株最大耐受NaCl的浓度为30%,为中度嗜盐微生物.

2.4不同Na2CO3浓度对菌的生长的影响

分别配制含有0.2、0.25、0.3 M Na2CO3的富集培养基,将菌株NM-1在30 ℃条件下振荡培养,每24 h测定培养液吸光度,绘制生长曲线如图3 所示.

由图3可以看出,菌株NM-1在Na2CO3浓度为0.25 M条件下,吸光度最大,均高于0.2 M和0.3 M条件下的吸光度,而在0.3 M Na2CO3浓度下,吸光度最小,且基本没有变化,因此,菌株NM-1生长的最适Na2CO3浓度为0.25 M.

2.5细菌系统发育树

菌株NM-1 16S r RNA 序列长度为1 415 bp.将序列进行BLASTn 比对及利用CustalX2.1和Mega5 软件构建系统树,如图4 所示.

由图4可以看出,菌株NM-1 16S r RNA序列与Halomonasvariabilisstrain SL121(JN645866)以及HalomonasvariabilisstrainHTG7(AY204638)序列的相似度最高,均为98%,且三者同在一个分支上,结合菌株NM-1所处的系统树位置,初步判定菌株NM-1应为盐单胞菌属(Halomonassp.).

3结束语

盐单胞菌属(Halomonas) 属于盐单胞菌科, 为革兰氏阴性、好气杆菌, 能在盐度为0%～ 32% (w/v) 条件下生长.作者从黄河三角洲盐碱地土壤中分离到一株耐盐碱菌株NM-1.该菌株生长最适pH范围为8.0～10.0,最大耐受NaCl的浓度为30%,为中度嗜盐微生物,生长的最适Na2CO3浓度为0.25 M.该菌株形态特征及生理生化性质与耐盐单胞菌属基本一致,与盐单胞菌属的几个相近种相同的特征有:革兰氏阴性,氧化酶、过氧化氢酶阳性,具反硝化作用,淀粉水解阴性.结合菌株16S rDNA序列相似度以及系统分类学位置,基本判定菌株NM-1属于耐盐单胞菌属(Halomonassp.),建议命名为Halomonassp. NM-1(AB917466).

参考文献：

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(责任编辑于敏)

The isolation of a halotolerant bacteria from Yellow River Delta

saline-alkali soil and the analysis of its salt tolerant capability

LU Hong-sheng, XU Ying-ying, YU Meng-meng, ZHANG Qing-ying,

WANG Jian-yan, TAN Hao-chen

(College of Chemical and Environmental Engineering,Shandong University of Science

and Technology, Qingdao 266590, China)

Abstract:A high salt tolerant strain NM-1 was isolated from Yellow River Delta saline-alkali soil and was characterized for its morphology, biochemical properties, the growth under different concentration of NaCl and Na2CO3, and 16S rDNA sequences. The results showed that strain NM-1 was gram negative, rods. Colonies were yellow, round, moist and smooth. Strain NM-1 could utilize glucose, lactose and sucrose, not starch and gelatine. The growth pH ranges was from 8.0 to 10.0. The tolerant concentration of NaCl for strain NM-1 reached up to 30%. The optimum concentration of Na2CO3for strain NM-1 to grow was 0.25 M. 16S rDNA sequences analysis proved the high homology of 98% between strain NM-1 with Halomonas variabilis (AY204638) and Halomonas variabilis (JN645866). Based on its morphology and biochemical properties, strain NM-1was regarded as one member of Halomonas genus and named as Halomonas sp. NM-1(AB917466).

Key words:saline-alkali soil; Halomonas; isolation and identification

中图分类号：X703

文献标志码:A

文章编号:1000-2162(2015)04-0103-06

作者简介：陆洪省(1972-),男,山东沂水人，山东科技大学副教授，博士(后),硕士生导师.

基金项目:山东省博士后创新基金资助项目(201201008)

收稿日期：2014-12-05

doi:10.3969/j.issn.1000-2162.2015.04.018