干细胞治疗耳聋研究进展

刘日渊赵立东丛涛杨仕明解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科解放军耳鼻喉科研究所(北京100853)



干细胞治疗耳聋研究进展

刘日渊赵立东丛涛杨仕明
解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科解放军耳鼻喉科研究所(北京100853)

【摘要】干细胞治疗耳聋是近些年耳科的研究热点之一，本文通过对干细胞耳聋治疗相关的文献进行综述，从干细胞用于内耳结构的替代或修复的基础、干细胞植入的方式、干细胞移植安全性方面，对干细胞治疗耳聋的可行性进行论述，认为干细胞的内耳移植治疗已具备一定的基础，在移植前需对细胞的分化进行更精准的控制，并且可以与传统的治疗方式（如人工耳蜗植入术）结合使用。

【关键词】干细胞；耳聋；移植

This work was supported by:Major State Basic Research Development Program of China (973 Program)（2012CB967900）; National Natural Science Foundation of China（81271082）; Military Key Program（BWS14J045）.Declaration of interest:The authors report no conflicts of interest.

感音神经性耳聋是内耳、耳蜗神经、脑干听觉通路及听觉中枢病变导致的听力下降的统称。根据不同的感音神经性耳聋的类型，可以选择不同的治疗方法，如突发性耳聋可以选择药物治疗，遗留一定程度听力损失的可以分别选择助听器、振动声桥、骨导助听器、人工耳蜗植入手术等，但这些方法的效果仍然各有其局限性。且上述治疗方法各有不同适用条件，仅能尽力去补偿残余听力，不能作为根治方法。所以，学者们仍然在不断探索能够使患者的听力尽可能恢复并接近正常人听力的治疗方式，即生物治疗，如干细胞治疗、分子治疗和基因治疗等手段[1]。本文就干细胞治疗耳聋作综述。

1　干细胞用于内耳结构的替代或修复的基础

内耳包括耳蜗和前庭，耳蜗是感受声音的器官，其Corti器的毛细胞感受压力后产生动作电位，传递至通过Habenular孔的神经，到螺旋神经节神经细胞，再继续向上传递最终到听觉皮层进行处理。每个环节受损都会影响听力，而当前研究的热点主要针对毛细胞或神经细胞的替代与修复。

干细胞替代治疗是指生物原有正常结构损伤或改变后，利用干细胞多能性，定向诱导分化出与原来形态功能相同的结构的一种治疗，这种治疗方式恰恰可以弥补内耳毛细胞的不可再生。首先，需要解决能否向神经细胞或是毛细胞诱导的问题。Kazuo[2]、Qin[3]等先后将胚胎干细胞、诱导多能干细胞和骨髓间充质干细胞诱导成与毛细胞类似的细胞，表达毛细胞标志物myosinⅦA，从形态上可见细胞生长静纤毛样的突起；He还通过使用EGF和bFGF调控细胞生长，将骨髓间充质干细胞向神经细胞方向诱导分化，表达神经前体细胞的标志物nestin蛋白。Li[4]通过对鼠的胚胎干细胞进行体外诱导，使其分化为毛细胞前体细胞，该细胞不仅表达nestin蛋白，还表达Pax2，BMP7和Jagged-1等听泡前期发育的特征性表达物。对前体细胞进一步诱导，Pax2和BMP7表达下降，开始表达成熟感觉上皮的标志Math1、Brn3.1和Jagged-1，以及毛细胞标志物myosinⅦA、espin、parvalbumin3和α9 acetylcholine receptor等等。进一步将前体细胞移植到鸡胚的听泡中，在听泡上皮的穿刺部位，见部分前体细胞迁移至其中并进一步分化成熟，在移植后14天表达epsin。Koehler等[5]在体外通过调控BMP （Bone Morphogenetic Protein）、TGFβ和FGF（Fibro⁃blast Growth Factor），使小鼠胚胎干细胞团块发育成听板样的皮层，释放出携带前体细胞的囊泡，分化成带有动静纤毛的毛细胞，进一步证明该囊泡的结构以及生化功能都与发育中的前庭终末器官非常相似。除了对内耳毛细胞的替代研究，内耳神经的替代治疗也成为可能。Shi等人[6]在体外将人类胚胎干细胞诱导成表达Pax2和nestin的神经前体细胞，通过移除生长因子FGF-2后，可发现少量神经细胞和胶质细胞。通过添加BMP4能提高神经细胞的诱导量：在体外与去神经的感觉上皮接触后，能表达神经突触的标记物。Chen[7]进一步验证了定向分化为神经前体细胞后的电生理功能，能检测出单动作电位，将其移植到听神经病模型中，不仅可以观察到细胞迁移、分化，还能对损失的听力产生修复作用。

虽然暂时没有研究可证明类毛细胞细胞的生理学特征，但这些研究的结果至少表明，不同类型的干细胞可以开始向毛细胞或者神经细胞的方向诱导分化，为替代治疗的施行奠定基础。

除了利用干细胞进行替代治疗，还可利用干细胞分泌的细胞因子，达到修复的目的。Kamiya等[8]在线粒体毒素造成耳蜗纤维细胞的损伤模型上发现，移植间充质干细胞的实验动物的听力恢复情况较对照组好，免疫组化实验发现移植后干细胞的连接蛋白表达阳性，提示可能修复钾离子循环通路。另一可行方式是利用基因修饰的干细胞作为载体，产生促进内耳修复的因子。在BDNF无义突变的鼠模型身上，NT-3 (Neurotrophin-3)启动子调控的BDNF（Brain-Derived Neurotrophic Factor）使前庭神经元向耳蜗底回发出大量突起[9]，虽然这些前庭神经纤维最后并没有进入Corti器连接毛细胞，但提示了这些神经生长因子对突触生长的趋化作用。另外，已有研究证明BDNF-间充质干细胞释放的BDNF可以有效阻止阿尔茨海默病的病变进展[10]。BDNF通过增加抗氧化酶谷胱甘肽还原酶活性和超氧化物歧化酶活性减轻氧化应激，可提高干细胞存活率[11]。所以，基因工程的干细胞分泌特定的因子也可促进内耳的修复。

2　干细胞植入的方式

干细胞移植的方式有全身移植和局部移植。全身移植包括静脉注射[12]，肌肉注射。局部移植包括蛛网膜下腔穿刺移植[13]等等，其中对于内耳可选的注射路径有：圆窗[14-15]、半规管[8]、中阶、蜗轴[16]、耳蜗外侧壁[17]等。圆窗入路注射移植和外半规管入路注射移植可以归结为一类，都通过外淋巴液路径，借助外淋巴液的流动促使细胞迁移。其中圆窗入路与临床操作较接近，在动物身上操作也比较简易。

以Cortis器为目标，干细胞的移植需要克服内耳结构的物理屏障。从中阶移植（内淋巴径路）的干细胞如果要进入Cortis器，需要通过盖膜或者毛细胞和支持细胞形成的网状结构。毛细胞损伤可能出现一个潜在的腔隙，但是其周围的支持细胞会扩大管腔面填塞缺口，从而限制或阻止向内淋巴液移植的干细胞进入Cortis器。此外，内淋巴液中的高钾环境也可能损伤移植的细胞。对于鼓阶等外淋巴径路移植的干细胞，必须通过由各种胶原形成的基底膜等结构或由上皮细胞和间质细胞形成的前庭膜。以螺旋神经节部位为移植目标要通过骨螺旋屏障，骨壁上的齿孔可以提供足够大的空间使细胞迁移至Rosen⁃thal’s canal[18]，另外蜗轴穿刺移植细胞可直达目标部位，但操作困难且易引起损伤。

最后，若需要重建功能，例如毛细胞，则还须与螺旋神经节神经元形成功能性突触链接。对于以螺旋神经节为目标的移植，除了需要通过蜗轴的骨质，还需要移植的细胞与毛细胞和脑干听觉的目标区域形成突触链接。

通过探索实践，对于内耳方向的移植有了进展。Corrales等人[16]使用Ouabain将沙鼠造成耳聋模型，并把小鼠胚胎干细胞诱导成的神经前体细胞移植到蜗轴，发现移植物发出突起，通过Rosenthal's canal，经过骨螺旋板，延伸至受损的Cortis器。Mark A.Parker[15]通过鼓阶打孔将干细胞移植到噪声性耳聋的模型中，并且能观察到向Rosental管和Cortis器的迁移，Zhao 等[19]进一步观察到移植细胞迁移至中阶，抵达Cortis器，并且表达myosinⅦA。李等[20]在鼓阶打孔移植术后通过ABR测试证明该移植方式对听力影响不大。Kamiya[8]通过后半规管注射间充质干细胞，在壶腹嵴和鼓阶可以观察到迁移的干细胞。Tamura T等[21]通过外半规管注射技术[22]注射顺铂等药物造成损伤，再通过圆窗将浓度达105个细胞每微升浓度的细胞干细胞移植到蜗轴。上述研究证明一些移植的细胞向相关部位迁移，但其具体迁移机制，有待进一步的研究。张[17]在Hildebrand[23]的研究基础上，利用耳蜗外侧壁的螺旋韧带和血管纹移植干细胞，发现细胞可以沿着基底膜迁移到受损的螺旋神经节区域并且能表达Tubulin。归纳当前的研究，干细胞而抵达目标位置后，可观察到迁移细胞向某一类型的细胞分化的趋势，如神经元、神经胶质细胞、类毛细胞等。目前评估特定细胞类型的分化主要依赖细胞种类的特异性标志物，但这些细胞是否具有相应的功能还有待研究。

还有一种假设，可以利用干细胞针对性损伤部位释放的因子产生迁移，例如趋化因子Stromal Cell-De⁃rived Factor-1 (SDF-1)。放射或者炎症损伤可促进肝脏胆管上皮释放SDF-1，吸引人类或鼠类的前体细胞，抵达损伤部位[24]。在耳蜗可否利用这种趋化性，需进一步研究。

3　干细胞移植安全性

干细胞移植相关的安全问题主要是细胞毒性和成瘤性。在体观察细胞毒性可通过体重、进食量、进水量的变化，以及血液生化检查、尿常规等间接检测，动物死亡后可行病理检查观察病变部位；成瘤性的检测可通过间接观察动物体重、取材后将移植处和相应脏器进行形态对比等手段。对于成体干细胞，尤其是间充质干细胞的研究比较多。Ra等人[12]曾用免疫缺陷小鼠检查脂肪间充质干细胞的细胞毒性及成瘤性：使用三种浓度2×106/kg、2×107/kg和2×108/kg尾静脉注射。细胞毒性观察时长13周，成瘤性观察时长26周，实验组与对照组相比，均无明显异常。其进一步的临床试验是将患者自体的脂肪间充质干细胞回输，无异常反应。佟[25]等人将骨髓间充质干细胞移植入裸鼠中观察分析，认为骨髓间充质干细胞在15代以内植入裸鼠体内无成瘤性，其风险随体外培养代数增加而增加。而对于胚胎干细胞，自分离出来，就发现和畸胎癌细胞具有很多相似性，比如多能性标志的表达和畸胎瘤的形成能力。后来Takahashi[26]等将OCT4、SOX2、KLF4、c-Myc转录因子导入成纤维细胞，使之重编程为类似"胚胎干细胞"形态的多能干细胞，即"诱导多能干细胞"。但Yamanaka[27]等后来的研究发现，在经过重编程基因改造的121只实验鼠中有20%发生了肿瘤病变。综上，间充质干细胞较胚胎干细胞、诱导多能干细胞安全。

按照干细胞的来源以及供、受体的遗传背景进行分类，干细胞移植可以分为：（1）自体移植，这种同基因、自身-自身的移植方式不会产生排斥反应。（2）同基因移植，所有基因位点均相同的移植，一般不产生排斥反应。（3）同种异体移植，是指种内遗传背景不同个体间的移植，其强烈、快速的排斥反应由主要组织相容性抗原（Major Histocompatibility antigen,MHC抗原）引起，而缓慢、温和的反应则由次要组织相容性复合抗源（Minor Histocompatibility antigen，mH抗原）引起。（4）异种移植，指不同种属个体间的移植，其排斥反应的可能性最大、最严重。当前的研究手段如免疫组织化学，常借用不同种属的抗体差异对移植后的干细胞进行标记。其优点在于提高组化染色的特异性，但更容易引起排斥反应。与其他类型干细胞相比，间充质干细胞相对安全，是因为它能抑制CD4+的T细胞增殖、阻止树突状细胞的成熟、促进T调控细胞的生成、产生免疫调节因子如prostaglandinE2(PGE2) transforming growth factor-1(TGF-1) interleukin-10 (IL-10) hepatocyte growth factor(HGF)等[28]。虽然主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility complex,MHC）中的NK细胞对异种移植的间充质干细胞也具有杀伤作用，但通过基因修饰使间充质干细胞表达HLA-E/β2 microglobulin和HLA-G molecules，可以降低NK细胞的杀伤作用[29]。Li统计94篇关于干细胞跨物种移植的文献，总结得出：人类间充质干细胞异种移植后至少在7个物种中起效，同时源于其他物种（如猪、大鼠、豚鼠）的干细胞也可以跨越物种界限作用[30]。所以，就目前基础试验的异种移植研究来说，间充质干细胞是较好的选择。

4　总结与展望

干细胞向毛细胞或神经细胞的定向诱导分化、干细胞内耳移植的方式的探索、干细胞移植的安全性研究为干细胞的体内移植奠定了基础。

在移植之前，应对细胞的分化方向的控制有更好的研究。移植细胞的分化阶段、移植时间点和方式的选择都需要进一步探索。例如，毛细胞前体细胞在什么阶段移植更利于与周围的细胞和神经纤维都形成有效的突触？干细胞移植到蜗轴后，如何使其在施旺细胞的包绕下生长？基因工程干细胞该以什么方式移植才能与干细胞产生最大的协同作用？所以，前体细胞移植以及配合基因工程干细胞的移植都将是未来的研究方向。

传统内耳移植方式如圆窗入路、蜗轴移植都会对内耳结构产生一定的损伤，不利于临床残余听力的保护。未来可探索对内耳损伤降到最小的移植方式：腰椎穿刺蛛网膜下腔移植入路[31]。从解剖角度看，内耳的外淋巴液与脑脊液相通，所以，可尝试通过蛛网膜下腔入路将移植的干细胞送抵内听道。但是，干细胞是否可以通过屏障进入内耳或是通过分泌因子影响内耳，需继续研究。

当前临床上有耳蜗神经发育不良或未发育的患者，人工耳蜗植入的效果较差甚至无效[32]。结合电刺激对干细胞影响的研究结果[33]，干细胞移植修复内耳与传统的治疗方式如人工耳蜗植入术结合也将会是解决这一类临床问题的研究热点。

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·听觉研究新模型专辑·

Research and Development of Stem Cell Therapy for Deafness

LIU Riyuan ,ZHAO Lidong ,CONG Tao ,YANG Shiming
Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery,People’s Liberation Army General Hospital,Institute of Otolaryngology of the People’s Liberation Army,Beijing,100853
Corresponding author:YANG ShimingEmail:yangsm301@263.net

【Abstract】In recent years,stem cell therapy for hearing loss has become a hot topic in the field of otology.This paper contains a review of the literatures on stem cell therapies for hearing loss,discusses on its feasibility from the perspectives of the basis for replacing or repairing inner ear structures,stem cells transplantation approaches and its safety.and concludes that transplanting stem cells into the inner ear is feasible,although more precise control over cell differentiation is required before actual transplantation,and can be used together with other traditional therapies,such as cochlear implants.

【Keywords】Stem Cell；Hearing Loss；Transplantation

收稿日期：（2015-11-27）

通讯作者：杨仕明，Email:yangsm301@263.net

作者简介：刘日渊，博士，医师，研究方向:耳科学

基金项目：国家“973”计划重大科学研究计划干细胞项目（2012CB967900）；国家自然科学基金面上项目（81271082）；军队重点课题（BWS14J045）

DOI:10.3969/j.issn.1672-2922.2016.01.002

【中图分类号】R764.43

【文献标识码】A

【文章编号】1672-2922（2016）01-6-4