荣昌猪遗传性听力缺陷家系的发掘与应用

陈伟陈磊杨仕明1中国人民解放军总医院，耳鼻咽喉头颈外科（北京10085）2中国人民解放军空军总医院，耳鼻咽喉头颈外科（北京10006）重庆市畜牧科学院（重庆402460）



荣昌猪遗传性听力缺陷家系的发掘与应用

陈伟1，2陈磊3杨仕明*1
1中国人民解放军总医院，耳鼻咽喉头颈外科（北京100853）
2中国人民解放军空军总医院，耳鼻咽喉头颈外科（北京100036）
3重庆市畜牧科学院（重庆402460）

【摘要】猪作为继小鼠之后的又一类模式动物，正受到包括比较生物学、发育生物学、医学遗传学、畜牧学等在内的多领域科学家的高度关注。本文主要介绍我国特有的荣昌猪品系中的一个变异群体－“荣昌猪遗传性听力缺陷家系”，其突变位点，病理表现和发病规律与人类Waardenburg综合征2A型极为相似。此家系在听觉医学研究中的应用为研究感音神经性耳聋的干细胞移植，早期基因干预治疗、听觉植入等创造了条件。为听觉医学领域的相关研究提供了理想的大型哺乳动物模型。

【关键词】荣昌猪；动物模型；听觉医学

Financial funds：This work was supported by grants from the National.Basic Research Program of China (973 Program) (#2012CB967900；2011CBA01000),the National Natural Science Foundation of China (NSFC #81271082).Special Cultivating and Developing,Program of Beijing Science and Technology Innovation Base.Competing Interests:The authors have declared that no competing interests exist.

动物模型在生物医学研究中的地位极其重要。成功的动物模型有助于更方便、有效地认识人类疾病发生、发展的规律和研究防治措施。传统耳科研究领域的常用动物模型主要是啮齿类动物。这些动物体型较小，易操作，但其内耳体积较小，发育成熟较晚，解剖结构与人类相差甚远，种种原因阻碍了此动物模型在耳科领域的进一步应用。猪是实验动物中除灵长类外和人类进化关系最近的物种，与人类在解剖、基因及病理生理学上相似，尤其是中耳、内耳各器官的解剖结构与人类很相似，体积相对较大，在形态学、分子生物学研究方面更加直观[1]。因此，猪可能成为耳科研究的最理想实验动物，在耳科学领域具有重要的实用价值。本文主要介绍我国特有的荣昌猪遗传性听力缺陷家系的发现经过，鉴定过程，展示荣昌猪作为耳科学领域实验动物模型的优势。同时介绍荣昌猪耳聋家系动物模型在耳科领域,包括聋病的机制，干细胞治疗相关基础研究、听觉植入相关研究等方面的应用现状。

1　猪作为耳科动物模型的优势

猪是医学实验动物中除灵长类以外和人类进化关系最近的物种。家猪作为继小鼠之后的又一类模型动物，正受到包括比较生物学、发育生物学、医学遗传学、畜牧学等在内的多领域科学家的高度关注，解剖结构、进化速率和代谢率等方面的差异造成鼠作为人类听力缺陷动物模型的再现性和可靠性较差，然而这些方面恰好是家猪模型的优势。相关的一系列前沿生物技术与基础数据正日新月异的发展，这更为猪作为听力相关疾病的动物模型研究提供了良好的前提条件。

耳聋是一种严重影响人类生活质量的感觉障碍性疾病,在世界范围内,大约每1000名新生儿中就有1名先天性耳聋患儿,其中50%患儿的耳聋与遗传因素有关[2]。耳聋基因与遗传性耳聋关系密切，目前发现，人类基因组中有200多个基因与耳聋相关[3、4]。遗传性耳聋的基因筛查、致病机理和基因治疗手段等方面一直是耳科研究领域的热点。由于人类颞骨标本的取材限制以及在人体进行相关听功能、电生理检测的局限性，使得动物模型成为研究听觉相关遗传疾病的必要工具[5、6]。小鼠、大鼠、豚鼠等啮齿类动物是最常见的听觉研究动物模型，但这些小型哺乳动物的内耳解剖、发育和体积与人类相差甚远[7]，并且从胚胎期开始其个体发育模式与人类存在巨大的差异，因此一些发育性的疾病无法在鼠模型上再现。在遗传性听力缺陷研究方面，目前亟待突破的毛细胞再生、人工听力重建、早期听力挽救等方面的研究均无法深入开展[8]。可见,在遗传性耳聋的病理机制及防治研究中，特别需要大型哺乳动物模型参与。而猪就是一类理想的模型动物。

在解剖学和形态学方面，猪与人类相比具有极高的相似性。猪中耳和内耳解剖研究发现猪与人在听觉器官的形态和结构方面具有极高的相似性。如猪的中耳腔形态和咽淋巴组织结构均与人类高度一致，非常适合作为中耳炎模型[9]。猪耳蜗骨壁的厚度、强度与人更为接近，可以被应用于耳蜗开窗术[10]。耳蜗精细断层扫描显示猪的耳蜗结构与人类高度相似[11]。此外猪内耳形态在出生时已基本发育成熟，并具备正常听力。在遗传学和基因组学方面，猪与人类也有非常相近的进化关系。猪与人的基因组大小相近，基因数量和基因结构类似。大量的人类致病基因能够在猪基因组中找到同源基因，这些基因的突变在人和猪上都能产生类似的遗传效应和病理表型。随着下一代测序技术的飞速发展，猪基因组数据也越来越完善。2010年11月新版基因组数据—Sus Scrofa 10.0公布,共包含2.62Gb的数据，其测序深度从9.0版的4X增加到40X，基因组覆盖度大大增加，极大加快了猪基因组学研究的步伐。随后大量的猪基因组测序数据被报道出来，至今为止已经有至少3个完整的猪参考基因组问世，分别代表了不同类型的猪品种。因此猪作为动物模型在耳科领域应用前景十分广阔。

2　荣昌猪遗传性听力缺陷家系的发现与鉴定

荣昌猪是我国不可多得的宝贵地方猪品种资源，除具有肉质优良、繁殖性能好、适应性广、抗逆性强等地方猪种的一般优良特性外，它还是我国地方猪种中唯一的以白色皮毛为主的品种。典型的荣昌猪毛色是躯体全白，头部眼圈周围有面积不等的黑色皮肤和毛发，即所谓的“黑眼膛”毛色，这是其最著名的品种特征，因此荣昌猪又被称作“眼镜猪”、“熊猫猪”。

在荣昌猪保种繁殖过程中，发现荣昌猪群体内偶尔会出现黑眼圈消失的纯白个体，研究发现这些个体存在多方面的遗传缺陷：

首先是色素沉积异常，这种纯白荣昌猪个体除了毛（肤）色方面异常外，还表现出虹膜变浅的特征，其角膜瞳孔外区域较普通荣昌猪的棕色更浅，呈浅蓝色；其次还表现出听生理异常，纯白荣昌猪个体均表现出先天性的听力缺陷，对声音刺激没有反应，在生产管理的过程中造成诸多不便，如容易压死仔猪、驱赶转移困难等。客观电生理测定脑干听觉诱发电位（ABR）结果表明参测的所有纯白荣昌猪在各频率的仪器最大输出均不能引出ABR波形，表现出重度耳聋。此外还出现了内耳感觉上皮形态的异常，全耳蜗基底膜铺片和内耳扫描电镜结果表明，纯白荣昌猪耳蜗外毛细胞大量消失，内毛细胞虽然存在但纤毛融合。这种毛细胞的缺失和纤毛的融合正是导致耳聋的直接原因。

遗传分析结果表明，纯白个体表现的这些遗传缺陷表型符合常染色体单基因隐性性状的遗传规律。因此将荣昌猪中出现的这个变异群体命名为“荣昌猪遗传性听力缺陷家系”，同时将携带这种遗传缺陷和突变基因的纯白荣昌猪命名为Mitf-/-，而正常野生型个体为Mitf+/+。随后利用全基因组关联分析的方法将耳聋性状突变基因定位于13号染色体约74M附近的一段700K的区间内，该区间中只有一个已注释的基因Mitf，因为该基因的突变在人、牛、鼠、马等物种中均导致听力-色素综合征，因此确定该基因就是导致荣昌猪耳聋的致病基因。为了确定具体的致病突变，对Mitf基因进行了突变筛查。对该基因的所有外显子和部分非编码调控区域的分析一共发现了21个与白化、耳聋性状共分离的突变，其中只有一个同义突变发生在编码区内，其他的突变均发生在基因的内含子和启动子中间。

表达谱分析表明在出生前后的各个发育阶段，Mitf-/-个体的Mitf-M表达量均出现了消失的现象，而Mitf-A和Mitf-H均未受到影响。而Mitf-M是特异性表达在黑色素细胞中的转录变异体，他是黑色素细胞生存、迁移的特异性调控因子。因此我们认为，致病突变的遗传效应是导致Mitf-M特异性的表达消失，从而造成血管纹中间层细胞和全身黑色素细胞的缺失，进而导致耳聋、白化表型。

以上推测，致病突变应该与且仅与Mitf-M的转录调控有关，因此将致病突变的范围缩小到Mitf-M特异性的调控因子M启动子（M-promoter）中，在21个共分离的突变中，有8个位于该区域。利用双荧光素酶报告实验，对这些突变在转录活性方面的遗传效应进行了分析。结果表明，位于Mitf-M转录起始位点上游约7.6kb处的两处插入突变和一个双碱基置换对M启动子的转录活性产生了显著的影响，因此致病突变的范围进一步缩小到这三处突变中。随后，利用EMSA实验分析了这三处突变对与DNA-蛋白结合能力的影响，结果表明，其中一个14bp的插入突变，导致了新的蛋白结合活性，而其余两处突变对于该片段的蛋白结合能力没有影响。因此最终将致病突变确定为位于转录起始位点上游7651bp处的一处14bp插入，该突变产生了一个新的Sox家族转录因子的结合位点，对Mitf-M的转录起到了负调控的作用。

至此，成功确定了Mitf基因的启动子区域内的一个14bp的插入突变是导致荣昌猪遗传性听力缺陷的致病突变，明确了这种遗传疾病的致病机理与发病规律。建立了一种新的人类遗传性神经性听力缺陷的大型哺乳动物模型。

3　人工耳蜗临床试验平台的构建

据国内相关统计，目前我国听力言语残疾者达2800万之多，并仍以每年3万聋儿的速度在增长。其中，感音神经性耳聋占绝大多数，目前最佳的治疗手段为人工耳蜗植入。自1984年美国FDA正式批准多导电子耳蜗在成人应用至今，全世界已有30万聋人通过植入电子耳蜗而重新获得听力。这其中包括10万先天性耳聋的儿童，得益于此技术而回到有声世界，并开启了与正常儿童同样精彩的人生。

但是，电子耳蜗并不能解决所有耳聋患者的苦恼，如感染造成的双侧耳聋，常因耳蜗骨化、纤维化造成电极插入困难；听神经病患者，其电子耳蜗植入后的效果难以预料；双侧听神经瘤病（NF2）患者，切除肿瘤的同时也丧失了耳蜗植入的机会，不得不接受风险极大，效果远远不及电子耳蜗植入的听觉脑干植入治疗。与此同时，植入电子耳蜗的耳聋患者，也还有众多疑问不能解答。如大龄语前聋患儿，长期处于言语剥夺状态下，其电子耳蜗植入后效果很差，针对此类患者，如何进行耳蜗电极参数的个性化调整，无据可依；言语识别能力与植入电极位置、长度、通道数量的关系，仍不清楚。而这些都急切需要大型哺乳动物模型参与，其中猪就是一类理想模型动物。因此利用荣昌猪建立人工耳蜗试验、测试及开发平台势在必行。

通过前期对荣昌猪内耳显微CT测量数据显示，其耳蜗鼓阶可以容纳人类现用人工耳蜗电极，无需额外改制电极[11]。在对荣昌猪中耳、内耳解剖充分研究后，我们创建了耳后切口，面神经隐窝进路，圆窗入路的电极植入方式，植入体固定在颅顶。同时创建了颅顶缝合保护罩加防护外衣的方式给荣昌猪佩戴体外机。术后影像学检查显示电极插入位置良好，位于小型猪耳蜗第一、二转的鼓阶内。对耳蜗损伤轻微，植入位置良好，术中及术后EABR波形记录良好。与传统的动物模型相比，荣昌猪内耳解剖与人类相似，人工耳蜗电极不需要特殊制备，更加贴近临床试验要求，非常适合作为新型的人工耳蜗植入动物模型。

这一平台的建立具有指导耳蜗植入电极参数改进，新型植入电极设计制造的临床应用价值。很可能会带来电子耳蜗植入电极的极大改进，甚至突破性进展，如带有诱导听觉神经定向生长功能的电极。从而使目前的电子耳蜗植入难题，如耳蜗畸形，耳蜗纤维化等得以解决，使更多的患者受益。具有广阔的应用前景，及良好的社会、经济效益。

4　耳蜗干细胞移植疗法的探索

针对耳蜗毛细胞和(或)听觉初级传入神经元一螺旋神经元的退变或缺失的疾病根本。各国科学家正研究一种全新的治疗方法—干细胞移植。随着干细胞技术快速发展，该方法在动物模型中已取得可喜的进展[12,13]，但对于移植径路方面，如何在使内耳结构功能损伤程度最小化的基础上，将细胞移植到距离损伤部位最近的位置或者直接移植到损伤部位；同时在干细胞移植后如何驱动或诱导其到达治疗的靶向区域，仍需进一步的研究与探索。

本课题组的前期研究，建立了正常荣昌猪内耳解剖、手术方式以及形态、听功能数据库，发现猪的内耳和人类及其他动物相比在功能和形态上既具有相似性又存在差异；同时对白化耳聋荣昌猪进行家系构建和基因分析，确定精确的致病基因为Mitf-M基因，使得此耳聋动物家系遗传背景清楚，可以作为耳聋疾病的大型哺乳动物模型应用于耳科领域的研究；利用从胚胎到出生后不同发育阶段的自发突变型白化荣昌猪（Mitf-/-）和正常野生型荣昌猪（Mitf+/+）内耳形态学和听功能的比较分析，发现白化荣昌猪的耳聋是由Mitf-M基因突变导致内耳血管纹病理变化引起的，最终引发血管纹中间细胞消失，内耳钾离子浓度和耳蜗内电位的变化，导致ABR异常，听功能丧失，阐述了Mitf-M基因突变引发耳聋的病理机制。使我们进一步明确了胚胎发育过程中Mitf-M对血管纹和黑色素细胞发生作用的关键时间点和变化规律。这可能也是人类Waardenburg综合征2A型及Tietz综合征所致耳聋症状的原因。为研究人类Waardenburg综合征2A型感音神经性耳聋的干细胞移植，早期基因干预治疗、人工听力重建、毛细胞再生等提供了重要的基础数据，为人类Waardenburg综合征2A型耳聋的研究提供了理想的大型哺乳动物模型。

比较正常荣昌猪与基因突变耳聋荣昌猪的内耳超微结构，可以发现在出生后13天的耳聋猪耳蜗内，其中阶塌陷，并与前庭阶贯通、融合。这对我们选择干细胞移植的途经提供了重要的解剖信息。并且Mitf-M基因突变耳聋荣昌猪内耳血管纹病理变化，导致中阶的高钾环境消失，这对于干细胞移植是很有利的微环境。

本研究选择耳后入路，圆窗膜注射的移植途经。选用人来源的iPSCs（GFP标记）作为移植干细胞。所有动物均选择右耳为手术移植侧，左耳为对照侧。术前、术后即刻、术后1周测量听觉生理指标（听觉脑干诱发电位，ABR）。观察圆窗入路干细胞移植途经对听觉功能的影响，以及干细胞移植后听觉功能的变化情况。利用耳蜗冰冻切片，免疫荧光染色法及图像分析系统定量分析移植后干细胞存留情况（包括细胞密度、分布差异、时间梯度变化等）。通过耳蜗冰冻切片，免疫荧光染色法，图像定量分析系统分析干细胞移植后对内耳超微结构（包括螺旋神经节细胞数量、树突/轴突长度、分支数量等）的作用影响。手术步骤：1）麻醉：速眠新0.5ml肌肉注射，10分钟后连接呼吸机吸入异氟烷0.2ml/分钟行全身麻醉。2）体位摆放：荣昌猪右侧卧位，右耳朝上，左耳后海绵垫垫衬固定。3）消毒、铺单：碘伏消毒右侧耳周及颅顶部，常规铺无菌单。4）右耳后切口：右侧耳后，沿耳廓附着缘切口，长约5cm,上自耳廓上端，下至下颌角。切开皮肤、皮下组织，显露颌下腺，颈部肌群。沿腺体与肌肉间分离，直至乳突骨面。切断部分肌腱，分离显露外耳道后壁骨面。紧贴颌下腺，在外耳道后壁用电钻磨开一个3＊3mm的骨窗。可见外耳道后壁的软组织，推开后，显露出鼓膜以及面神经，鼓索神经，磨除部分外耳道后上壁骨质，显露出砧骨及镫骨头。5）显露耳蜗圆窗：磨除部分面神经表面骨质，游离面神经并向下移位。即可显露圆窗。6）圆窗内注射：将提前准备好的干细胞悬液，吸入10ul显微注射器内。刺穿圆窗膜，将干细胞悬液缓慢注入耳蜗鼓阶。间隔30分钟后，再次注射一次。用明胶海绵填塞圆窗龛。7）缝合切口：逐层缝合切口，手术结束。

5　基于活体基因组编辑的基因治疗技术探索

成簇的规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关核酸酶9（Cas9）的定向基因组编辑技术已经在研究遗传性疾病相关基因功能方面展现巨大的潜力。目前已经有通过腺相关病毒（AAV）将CRIS⁃PR/Cas9导入活体哺乳动物体内实现基因治疗的报道[14]。而荣昌猪模型的遗传缺陷是由一个位于Mitf基因转录调控区域内的Gain-of-function的突变产生的，只需要利用CRISPR/Cas9介导的非同源修复就能将这个Gain-of-function突变破坏，恢复Mitf基因的表达，因此荣昌猪模型是开展基于活体基因组编辑的基因治疗技术的理想模型。

本研究准备利用AAV将CRISPR/Cas9导入到早期Mitf-/-荣昌猪的内耳组织中，以期修复Mitf基因的突变，实现基因治疗。目前内耳组织已经成为CRIS⁃PR/Cas9介导基因治疗探索的热点，Zuris等已经利用脂质体活体转染的方式，将转基因小鼠模型内耳毛细胞中的GFP基因成功敲除[15]，这说明CRISPR/Cas9在内耳中是有广泛应用前景的。首先为了实现CRIS⁃PR/Cas9在猪基因组中的高效、定点编辑，利用猪的成纤维细胞在体外水平筛选出针对荣昌猪突变的一个高效切割位点，基因组编辑的效率可达到约50%。下一步的工作将集中于CRISPR/Cas9的导入时机和方式，以及导入后表型变化的测定。

6　听觉中枢可塑性研究的探索

中枢神经系统常常由于外周神经活动而产生可塑性的改变，这个反应机制就是所谓的“活动依赖可塑性”。听觉剥夺后以及给予受损的外周听觉感受器-耳蜗内电刺激(相当于声刺激)后，听觉中枢的结构和功能发生改变，即发生可塑性的改变或重组。语前聋或语后聋的感音神经性聋患者在聋后或人工听觉植入后听觉中枢可出现类似的可塑性改变。

应用大型哺乳动物研究听觉中枢可塑性是近来听觉研究的热点。荣昌猪耳聋家系模型在此方面具有独特的优势。首先本家系是自然育种形成的基因缺陷耳聋家系，与人类基因缺陷导致的先天性耳聋家系有良好的可比性；其次前期的研究已经明确导致耳聋的基因缺陷，家系的遗传背景清晰，便于对比分析研究；而且应用同一窝出生的荣昌猪模型进行干预研究，可以使中枢可塑性研究的参杂因素降到最低，得出的结果更有说服力。

为此，设计了初步的实验方案。实验对象：正常荣昌猪（听力正常6只），右耳植入电子耳蜗的白化荣昌猪（p30天3只，p100天3只），同一窝的白化耳聋荣昌猪（p30天3只，p100天3只）。拟观察内容：（1）正常荣昌猪听觉通路Bold-fMRI成像，观察蜗神经核，上橄榄核，下丘，内侧膝状体，听觉皮层在不同频率纯音（500Hz,4000Hz）刺激下的激活情况。（2）耳蜗植入后的白化荣昌猪（p30天2只，p100天2只），听觉通路Bold-fMRI成像，观察蜗神经核，上橄榄核，下丘，内侧膝状体，听觉皮层在不同频率纯音（500Hz,4000Hz）刺激下的激活情况。相互比较，并与正常听力猪比较。（3）利用H-MRS技术观察正常荣昌猪纯音刺激前后听觉皮层代谢情况变化。观察双侧听皮层N一乙酰天门冬氨酸(N—aceytlaspartate，NAA)、肌酸(creatine．Cr)、胆碱(choline，Cho)、谷氨酰胺和谷氨酸(glutamate／glutamine，Glx)等代谢物的波峰变化并进行半定量分析。（4）利用H-MRS技术观察耳蜗植入后的白化荣昌猪（p30天2只，p100天2只）纯音刺激前后听觉皮层代谢情况变化。观察双侧听皮层N一乙酰天门冬氨酸(N—aceytlaspartate，NAA)、肌酸(creatine．Cr)、胆碱(choline，Cho)、谷氨酰胺和谷氨酸(glutamate／glutamine，Glx)等代谢物的波峰变化并进行半定量分析。相互比较，并与正常听力猪比较。（5）正常荣昌猪，白化荣昌猪的MRI内耳水成像（3D成像）。（6）人工耳蜗植入后荣昌猪的MRI内耳水成像（3D成像）。

但是应用功能核磁共振成像技术存在的问题尚待解决，如植入体在磁场环境下的移位问题，核磁共振设备的背景噪声过大影响听觉皮层反射问题等。我们的后备方案是应用PET-CT技术，可以解决磁场干扰和噪声过大的问题。

7　应用展望

猪作为理想的实验动物模型已广泛应用于医药研究领域，一方面是应用猴等高级哺乳动物存在伦理学上的限制，另一方面是基于人们对猪与人类在解剖和功能方面相似性的认识逐步加深[16]。发掘的荣昌猪遗传性听力缺陷家系，在听觉基础研究以及临床遗传性聋疾病相关研究方面的应用前景十分广阔。以此为基础建立的人工耳蜗植入的大型哺乳动物实验平台，干细胞治疗遗传性耳聋实验平台，基因治疗遗传性耳聋实验平台，为更加直接地研究临床相关的人工耳蜗植入设备在体内的工作状态和各项数据，研究内耳植入耳蜗后的生理病理改变创造了条件。这些研究很可能会带来电子耳蜗植入设备的极大改进，甚至突破性进展。从而使目前的听觉植入难题得以解决，使更多的患者受益。因此，荣昌猪遗传性听力缺陷家系实验动物模型的深入开发和应用不仅具有观察分析大型哺乳动物内耳生物学行为及其机制的科学价值，而且具有基础医学向临床医学应用转化研究的临床应用价值。具有极其广阔的应用前景，及良好的社会、经济效益。

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·听觉研究新模型专辑·

Excavation and application of the Rongchang Pig hereditary pedigree connected to hearing defects

CHEN Wei1,2,CHEN Lei3,YANG Shiming*1
1 Department of Otolaryngology,Head & Neck Surgery,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,China.
2 Department of Otolaryngology,Head & Neck Surgery,Chinsese PLA Air Force General Hospital,Beijing 100036,China.3 Chongqing Academy of Animal Science,Chongqing 402460,China.Corresponding author：YANG Shiming Email:yangsm301@263.com

【Abstract】As a different class of animal model from mice,pig is being highly valued in areas including comparative biology,developmental biology,medical genetics and animal husbandry.Our representation describes a variation of the unique Rongchang pig strain－Rongchang hereditary pedigree connected to hearing defects .The mutation sites,pathology and pathogenesis are very similar to those in human Waardenburg syndrome type 2A.Application of this pedigree,in the field of hearing research,benefits the study on treatment of neurosensory hearing loss with stem cell transplantation,early genetic intervention,auditory device implantation,etc.Moreover,it provides an ideal model of large mammals with respect to hearing medicine sciences.

【Key words】Rongchang pig; animal model; hearing medicine science

收稿日期：（2015-12-28）

通讯作者：杨仕明，Email:yangsm301@263.com

作者简介：陈伟，博士在读，副主任医师，研究方向：电子耳蜗植入相关研究，内耳基因及干细胞治疗相关听觉医学研究

基金项目：国家973计划重大科学问题导向项目（2011CBA01000）；国家自然科学基金面上项目（81271082）；国家自然科学基金青年项目（81400472）；北京科技创新基地培育与发展专项；重庆市基本科研业务费项目（11611，14440）

DOI:10.3969/j.issn.1672-2922.2016.01.003

【中图分类号】R764

【文献标识码】A

【文章编号】1672-2922（2016）01-10-5