碳青霉烯酶检测方法的研究进展

朱　敏，邵　彪，庞　峰，赵岐刚

(聊城市人民医院 检验科,山东 聊城252000)



碳青霉烯酶检测方法的研究进展

朱敏，邵彪，庞峰，赵岐刚*

(聊城市人民医院 检验科,山东 聊城252000)

近年来产生了许多碳青霉烯酶耐药的革兰氏阴性杆菌，如肠杆菌科细菌，铜绿假单胞菌及不动杆菌属。碳青霉烯类抗生素是抵抗细菌侵犯的最后一道屏障，大量耐碳青霉烯酶菌株的出现导致临床面对多重耐药或者泛耐药细菌无药可用，对广大病患造成了不可挽回的损失。因此在临床工作中快速检测出碳青霉烯酶，通过有力措施预防其迅速的播散，才可为临床治疗提供有力的保障。碳青霉烯酶的检测方法不断改进完善，出现了改良Hodge实验、PCR检测、CarbaNP检测、紫外分光光度法、MALDI-TOF质谱分析法等，本篇文章就碳青霉烯酶及碳青霉烯酶的检测方法加以简述，为检验工作者选择检测碳青霉烯酶的方法提供参考。

1　碳青霉烯酶

碳青霉烯酶是一类可以水解碳青霉烯酶类抗生素的β-内酰胺酶，它包括Ambler分子结构分类的A、B、D三类酶。其中A类、D类为丝氨酸酶，B类酶为金属酶。A类酶包括由质粒介导的KPC-1、KPC-2、GES-2，由染色体介导的NMC-A、IME-1、SME-1、SME-2、SME-3，主要见于肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、黏质沙雷菌等肠杆菌科类的细菌中。A类酶的活性可以被克拉维酸或者他唑巴坦所抑制，对EDTA不敏感[1，2]。B类金属酶分布广泛，可被EDTA抑制。1989年Bush[3]首次将该酶归类为金属β-内酰胺酶。可分为天然金属酶及获得性金属酶，获得性金属酶有5个不同的基因家族即IMP、VIM、SIM-1、SPM-1和GIM-1。IMP家族多数由IMP-1基因突变产生，可以水解除氨曲南之外的β-内酰胺类抗生素，也不会被β-内酰胺酶抑制剂所抑制[4-5]。我国检出的类型主要是IMP-4、IMP-8、IMP-9。VIM-2型金属酶对碳青霉烯类抗生素水解活性最强，铜绿假单胞菌是VIM型金属酶主要携带者[6]。SPM-1是近年发现金属酶，其编码基因由一种新型的基因原件携带，通过基因重组作用介导这一类型的酶在细菌之间传播。SIM-1和GIM-1这两种金属酶比较少见，SIM型金属酶主要在韩国流行，而GIM型金属酶只在德国的几个城市传播。D类碳青霉烯酶主要存在于不动杆菌属中，对苯唑西林的水解能力很强，又称OXA酶。这类超广谱β内酰胺酶(CHDLs)被划分为OXA-23、OXA-40、OXA-51、OXA-58、OXA-143五组，以OXA-23为主，其次是OXA-48和OXA-50。blaOXA-51在野生型的菌株中不表达，但是在其5末端插入ISAba1序列后可以导致相应的β内酰胺酶的过表达[7]。OXA酶可以在不同的菌株中播散主要依赖于质粒或者转座子[8]。

2　碳青霉烯酶检测方法

我们日常工作通过药物敏感试验来确定菌株是否有碳青霉烯酶产生，以美国临床实验室标准化协会(CLSI)制定的碳青霉烯类抗生素折点来判断，但是需要花费36-48h甚至更长的时间，而且有的菌株并不表现出明显的碳青霉烯类抗生素耐药的改变，这就需要通过实验室检测确定菌株是否产生了碳青霉烯酶[9]。

2.1改良Hodge实验

改良Hodge试验(modifiedHodgetest，MHT)是CLSI在2009年推荐的检测肠杆菌科细菌碳青霉烯酶表型的常规方法。MHT法操作简便，微生物室一般都可以开展，因此被广泛用于产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的表型检测。具体步骤CLSI制定的药敏标准中有述。改良Hodge试验还可以用来检测铜绿假单胞菌及不动杆菌属中产碳青霉烯酶的菌株，但是敏感性及特异性比较低。检测金属β内酰胺酶如产IMP、VIM、NDM的菌株或者是产KPC的菌株需要抑制菌株的一些分子性能，这就需要专门知识并且需要较长的时间大约需24-48h。如果要检测OXA-48这一流行广泛的碳青霉烯酶，却没有任何的抑制剂可以使用[10-11]，所以改良Hodge实验检测碳青霉烯酶有它的局限性，且易产生假阴性。

2.2CarbaNP检测

随着耐碳青霉烯酶菌株所含耐药基因的日趋复杂，传统的检测方法特异性及敏感性受到挑战，检测产碳青霉烯酶菌株的方法有待革新。2012年PatriceNordmann[10]领导的团队提出了检测碳青霉烯酶的新方法称为CarbaNP法。2015 年CLSI药敏试验标准引入CarbaNP试验检测碳青霉烯酶。CarbaNP确证试验是一种肠杆菌科、铜绿假单胞菌和不动菌属细菌中碳青霉烯酶的表型检测方法，主要是基于碳青霉烯酶可以水解亚胺培南分子中的β内酰胺环使其氢键断裂，导致pH值降低使反应液的指示剂发生颜色的改变这一原理。CarbaNP检测方法又可以分为CarbaNP实验Ⅰ和CarbaNP实验Ⅱ

2.2.1CarbaNP实验Ⅰ取一环(约10μl)待测菌重悬于200μl20mmol/LTris-HCl裂解缓冲液中，混悬1min，室温孵育30min。10000g离心5min，取30μl上清加入到反应液中。反应液体系为100μl，包含0.3mg的亚胺培南西司他丁，0.1mmol/LZnSO4，以酚红溶液为溶剂。酚红溶液配置是0.5%的酚红母液2ml加入16.6ml的超纯水。反应体系置于37℃孵育2h，期间可以不断观察颜色变化。如果细菌产生碳青霉烯酶则颜色逐渐变为橘红色或者黄色。

2.2.2CarbaNP实验Ⅱ碳青霉烯酶分为A，B，D三组，A组丝氨酸碳青霉烯酶，其活性可以被克拉维酸或者他唑巴坦抑制；B组酶金属β内酰胺酶，其活性可以被EDTA抑制；D组酶的活性不被酶抑制剂和EDTA抑制[12]。以这三组酶的特点我们可以衍生出CarbaNP实验Ⅱ。我们可以设置三个孔，A孔加酶抑制剂，B孔加EDTA，C孔不加任何抑制剂。将同一菌株的裂解液分别加入这A、B、C这三个孔，如果A孔颜色不改变而B、C孔颜色改变则为A组酶，如果B孔颜色不改变而A、C孔颜色改变则为B组酶，如果A、B、C三孔颜色均改变则为D组酶。

CarbaNP检测方法可以很好的将碳青霉烯酶介导的耐药同其他机制介导的耐药区分，这些机制有头孢菌素酶过表达相关的细胞外膜通透性的缺陷、产生超广谱的β内酰胺酶，也可以将那些表达超广谱β内酰胺酶但是没有碳青霉烯酶活性的碳青霉烯酶易感菌株区分开来。CarbaNP法检测肠杆菌科和铜绿假单胞菌敏感率分别为91.1%和94.4%，特异性均为100%[13-14]。CarbaNP检测法具有多种优点：快速、重复性好、费用低、敏感性及特异性高，技术含量低，可以在普通的实验室开展此项试验，实现碳青霉烯类抗生素耐药菌株的快速筛查。

2.3CarbAcinetoNP

导致不动杆菌属耐药的碳青霉烯酶主要是超广谱β内酰胺酶，为D组酶。改良的Hodge实验已经用来鉴定碳青霉烯酶耐药的不动杆菌，此实验是基于检测碳青霉烯酶体外的活性，这一实验可以鉴定IMP及VIM，但是检测不到NDM及CHDL，故导致了一些假阴性菌株的产生，且敏感性及特异性均不高。由于不动杆菌属本身较低的渗透性，通过CarbaNP检测鉴定碳青霉烯酶耐药的不动杆菌属比鉴定肠杆菌科细菌及铜绿假单胞菌要困难一些，可以检测出不动杆菌属中的金属β内酰胺酶，却检测不出超广谱β内酰胺酶(CHDLs)。2014年LaurentDortet[15]将CarbaNP检测方法稍改变一下用来检测耐碳青霉烯酶的不动杆菌属，称为CarbAcinetoNP检测。将CarbaNP检测方法中蛋白裂解液改为5MNaCl，以减少蛋白裂解液对实验的影响,并且所用菌量增加一倍以增加酶的含量，亚胺培南的浓度由3mg/ml增加到6mg/ml，其余不变。CarbAcinetoNP检测可以检测出不动杆菌属中所有的碳青霉烯酶，敏感性94.7%，特异性100%[15-16]。

2.4紫外分光光度法

2012年BernabeuS[17]团队用紫外分光光度法检测肠杆菌科中碳青霉烯酶。其原理也是检测碳青霉烯酶对亚胺培南的水解来区分产酶株与非产酶株。临床分离的致病菌株接种到10ml胰蛋白胨大豆肉汤中，37℃摇床孵育18h。取1.5ml菌液15 000g离心10min,去掉上清加入500μl0.1mol/L磷酸盐缓冲液，含50μmol/LZnSO4，重悬所收集的细菌。放置于冰面1min,超声裂解1min,4℃、15 000g离心10min。上清用来做分析。紫外分光光度仪采用297nm的波长，电脑检测使用SWIFT2软件分析。石英比色杯中加入970μl0.1mol/L磷酸盐缓冲液内有50μmol/LZnSO4，15μl酶的粗提液，15μl10mmol/L亚胺培南，反应持续10min。比较每分钟混合液中的亚胺培南水解的吸收峰和单纯亚胺培南降解的吸收峰，阳性结果cutoff值为(5-10)-4。这一方法的敏感率100%，特异性为98.5%。需要专业培训的技术人员，耗费时间长，但是花费比较低，紫外分光光度仪及超声裂解仪的价位均不高，普通的实验室中亦可以配备。

2.5MALDI-TOF质谱分析法

基于MALDI-TOF生物质谱的组织成像技术 (MALDI-imagingmassspectrometry，MALDI-IMS)是一门新兴的分子成像技术，对于发现疾病生物标志物和研究药物代谢等方面具有重要意义，并具有良好的临床应用前景。BurckhardtI[18]和HrabakJ[19]带领各自的团队采用MALDI-IMS这一技术检测肠杆菌科及铜绿假单胞菌产生碳青霉烯酶，他们是通过检测美罗培南及厄他培南的代谢变化，敏感度是96.67%，特异性为97.87%。KempfM[20]等人则采用MALDI-IMS这一技术检测不动杆菌属中碳青霉烯酶，他们是通过检测亚胺培南的代谢变化，这是首次提及用此方法检测耐碳青霉烯酶的不动杆菌属，并且敏感度及特异性均为100%。LeeW,ChungHS[21]等在2013年采用MALDI-TOF质谱分析法检测了IMP-6、VIM-2、NDM-1、SIM-1、KPC-1、OXA-23、OXA-51 型的碳青霉烯酶。采用过夜培养的目的菌株一环(约10μl)加入1ml缓冲液中(0.1mMTris-HCl或者0.45%NaCl),一管中加入0.5g/L碳青霉烯类抗生素(IMP、MEM、ETP)，一管不含为对照管。两管均孵育约3h,12 000g离心90s,各取1μl上清加入靶板，干燥后每孔加入1μl基质液上机检测。通过检测碳青霉烯类抗生素的峰值变化来确定是否为产霉菌株。MALDI-TOF质谱分析这一检测方法所需时间为4h左右，能快速的检测碳青霉烯酶。虽然敏感度和特异性很高但是这一技术花费很高，普通的微生物实验室很难配备，同时需要专业的技术人员。

2.6PCR实验

采用PCR检测碳青霉烯酶仍是常用的方法，但是PCR实验的费用比较高，需要专业技术人员，耗时也较长，且PCR只能检测已知的碳青霉烯酶，无法发现新的酶。

2.7基因测序

基因测序检测碳青霉烯酶不常用，测序花费高，耗时长，需要专业技术人员，一般实验室无法完成。我们采用测序的方式是通常在PCR实验后，这样我们可以发现新的基因突变点。

综上所述，多重耐药泛耐药的革兰氏阴性杆菌特别是肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌及不动杆菌属已经遍布世界，碳青霉烯类抗生素是治疗这些细菌的最后一道屏障，但是碳青霉烯类抗生素耐药的细菌越来越多，碳青霉烯酶耐药基因可以质粒或者转座子的形式迅速播散，这就需要我们医务人员采用最快最有效的方法检测到它们的存在。碳青霉烯酶的检测方法不断的演变完善，我们目前工作中最常用的是MHT检测方法，但是这一检测方法的特异性及敏感性不高，并且一些特殊的碳青霉烯酶的表型不能检测到，易造成假阴性。MALDI-TOF质谱分析仪是新兴的一种检测仪器，BurckhardtI和HrabakJ带领各自的团队证实了我们可以通过这一检测仪器检测阴性杆菌中碳青霉烯酶，敏感度是96.67%，特异性为97.87%。这一检测仪器在大型综合医院很多都已经配备，我们完全可以采用这一方法来检测碳青霉烯酶的产生。2012年PatriceNordmann领导的团队首次提出了carbaNP检测方法。这一检测方法可以很好地检测到阴性杆菌中的碳青霉烯酶，并且可以根据一些抑制剂的使用来区分碳青霉烯酶的表型,可用于流行病学研究或感染控制。CarbAcinetoNP检测方法是依据CarbaNP检测方法稍作改变而来，能够更好的检测不动杆菌属中的碳青霉烯酶。这两种检测方法特异性及敏感性很高，而且检测时间短，费用低，普通的实验员就能操作，不需要任何仪器，可以在一般的实验室就能完成。2015年CarbaNP试验被引入了CLSI药敏试验标准，做为碳青霉烯酶表型的筛选试验。紫外分光光度法也可以用来检测碳青霉烯酶。PCR试验可以检测已知碳青霉烯酶的类型，测序则可以发现新的碳青霉烯酶的突变基因。我们可以很好的利用这些检测方法服务于广大病患，快速的检测出碳青霉烯酶存在的菌株，采取有力的预防措施，阻止他们的播散。

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山东省自然科学基金资助项目(ZR2014HL090)

1007-4287(2016)08-1415-04

2015-08-25)