青岛地区幽门螺杆菌多重耐药现状和突变特征分析

王莉莉，杨　超，董全江，孙桂荣

(1.青岛大学附属医院检验科，山东青岛 266003；2.青岛市市立医院中心实验室，山东青岛 266011)



青岛地区幽门螺杆菌多重耐药现状和突变特征分析

王莉莉1,2，杨超2，董全江2，孙桂荣1△

(1.青岛大学附属医院检验科，山东青岛 266003；2.青岛市市立医院中心实验室，山东青岛 266011)

摘要:目的分析青岛地区幽门螺杆菌(Hp)对常用抗菌药物的单一耐药和多重耐药情况，并探讨相关耐药基因突变的特征。方法从胃窦黏膜标本分离培养Hp，应用琼脂稀释法药敏试验分别检测Hp对克拉霉素、左氧氟沙星和甲硝唑的敏感性；采用聚合酶链式反应(PCR)方法扩增Hp克拉霉素耐药基因23S rRNA、左氧氟沙星耐药基因gyrA和甲硝唑耐药基因rdxA；PCR产物测序后应用ClustalW2软件进行序列比对分析。结果药敏检测发现，临床分离的134株Hp菌株对克拉霉素、左氧氟沙星和甲硝唑3种抗菌药物单一耐药率分别为40.3%、34.3%和43.3%；仅17.9% Hp对3种抗菌药物均敏感；多重耐药率为29.9%，三重耐药率为9.0%；左氧氟沙星+甲硝唑双重耐药率(3.0%)低于克拉霉素+左氧氟沙星(10.4%)，二者差异有统计学意义(χ2= 5.96，P=0.015)。耐药基因序列分析表明青岛地区23S rRNA 最常见突变位点为A2143G(77.8%)，gyrA基因突变最常见的突变方式为N87K(78.3%)，rdxA基因最常见的突变方式为第20、32位点核苷酸插入A，产生移码突变，突变率为44.8%。结论青岛地区Hp多重耐药率高，应根据药敏检测结果选择有效抗菌药物。左氧氟沙星可作为本地区根除治疗方案的一线用药。

关键词:幽门螺杆菌；克拉霉素；左氧氟沙星；甲硝唑；耐药

幽门螺杆菌(Hp)是一种革兰阴性、微需氧的螺旋状杆菌，是引起慢性胃炎、胃十二指肠溃疡、胃癌及MALT淋巴瘤的主要致病菌[1]。细菌耐药是引起Hp根除治疗失败的主要原因，而多重抗菌药物耐药会显著降低Hp根除率。研究发现，Hp耐药性有明显的地区差异[2-3]，经文献检索，未见青岛地区Hp多重耐药的相关报道。本研究通过分析青岛地区Hp对常用抗菌药物的单一耐药和多重耐药情况，并探讨相关的耐药基因突变特征，旨在为本地区临床提高Hp根除效率提供理论依据。

1资料与方法

1.1一般资料选择2011~2014年在青岛市市立医院经胃镜和病理检查确诊的慢性胃炎患者168例，男 95例，女73例，年龄30～72岁，平均(45.7±6.3)岁；胃癌患者90例，男53例，女37例，年龄41～79岁，平均(55.5±12.1)岁，所有患者均未接受过根除Hp治疗。胃窦黏膜标本经快速尿素酶实验证实Hp阳性。胃窦黏膜组织置于1 mL脑心浸出液(BHI)液体培养基中，-80 ℃保存备用。本研究方案通过本院伦理委员会审核，纳入研究前所有患者均签署知情同意书。

1.2仪器与试剂细菌基因组DNA提取试剂盒和2×Taq PCRMasterMix购自天根生化科技有限公司；BHI培养基、Hp选择性添加剂、细菌培养罐和微需氧产气袋均购自英国Oxoid公司；革兰染液购自济南百博生物技术有限公司；恒温箱购自美国Themo公司；普通PCR仪购自美国Labnet公司；凝胶分析仪购自美国Bio-rad公司；Hp标准菌株NCTC11637来自本实验室保存。

1.3方法

1.3.1细菌培养及鉴定胃黏膜活检标本接种于5%去纤维马血BHI琼脂固体培养基(含Hp选择性添加剂)表面接种划痕，置于37 ℃微需氧环境中(5% O2，10% CO2，85% N2)培养5～7 d。挑取透明样针尖大小菌落进行尿素酶、过氧化氢酶、氧化酶及革兰染色鉴定Hp并传代，2 d后收集细菌置于磷酸盐缓冲液(PBS)液中，-80 ℃保存，用于提取Hp基因组DNA。

1.3.2琼脂稀释法药敏试验分别制备含不同浓度抗菌药物(克拉霉素、左氧氟沙星和甲硝唑)的平板,各在其上划6个扇区,每个扇区接种1株细菌(108cfu/ mL)。同时各菌株平行接种于无抗菌药物的平板为对照。置37 ℃、微需氧条件下培养3 d观察结果。以无细菌生长的抗菌药物最高稀释度作为最低抑菌浓度(MIC)。根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)指南[4]，克拉霉素MIC≥1 μg/mL，左氧氟沙星MIC≥1 μg/mL，甲硝唑MIC≥8 μg/mL 定为耐药菌株。药敏质控采用Hp标准菌株NCTC11637与试验同步进行。

1.3.3PCR扩增采用细菌基因组DNA提取试剂盒按照说明书步骤提取Hp基因组DNA。分别扩增Hp克拉霉素耐药基因23S rRNA、左氧氟沙星耐药基因gyrA 和甲硝唑耐药基因rdxA。扩增引物由上海英潍捷基生物技术有限公司合成，序列详见表1。PCR反应体系为：引物各5 μmoL，模板DNA 20 ng，2×Taq Mix 12.5 μL，补双蒸水(ddH2O)至25 μL。反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min、52 ℃ 30 s(rdxA为50 ℃)、72 ℃ 1 min循环30 次，72 ℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测目的基因长度和完整性，见表1。

表1　　PCR扩增引物序列表

1.3.4基因测序及结果分析PCR产物切胶纯化后采用Sanger测序法进行基因测序(AB 3730XL测序仪，美国)，由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。采用MEGA5.1分子生物学软件分析耐药基因的核苷酸和氨基酸序列,并与Hp敏感株26695 基因序列(GeneBank CP003904.1)进行ClustalW2 比对，分析突变方式和突变位点。

1.4统计学处理应用SPSS17.0统计软件进行数据处理，计数资料以例数或百分率表示，选择χ2检验对计数资料进行统计，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1Hp单一耐药分析Hp阳性的活检标本共分离出134株Hp。琼脂稀释法药敏检测发现仅17.9%(24株)Hp菌株对克拉霉素、左氧氟沙星和甲硝唑3种抗菌药物均敏感，见表2，临床分离的Hp菌株对克拉霉素、左氧氟沙星和甲硝唑3种抗菌药物单重耐药率分别为40.3%、34.3%和43.3%，虽然左氧氟沙星耐药率低于克拉霉素和甲硝唑，但3种抗菌药物之间耐药差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2Hp多重耐药分析134株Hp中，有29.9%(40株)同时对两种或两种以上抗菌药物耐药。由表2可见，双重耐药的Hp菌株中，克拉霉素+左氧氟沙星耐药率为10.4%(14/134)，而左氧氟沙星+甲硝唑耐药率最低，为3.0%(4/134)，二者差异有统计学意义(χ2= 5.96，P=0.015)。这提示青岛地区Hp临床分离株对左氧氟沙星+甲硝唑联合用药比克拉霉素+左氧氟沙星更敏感。Hp临床分离株三重抗菌药物耐药比例为9.0%(12/134)，提示多重耐药菌株将严重影响临床根除Hp治疗的效果，见表2。

表2　　Hp对3种抗菌药物耐药分析

2.3Hp耐药基因突变特征分析Hp克拉霉素耐药相关基因23S rRNA、左氧氟沙星耐药相关基因gyrA和甲硝唑耐药相关基因rdxA分别经PCR法扩增全长序列，PCR产物直接测序。从GenBank中调取Hp26695的相对应序列，应用Clustal W2程序比对所有耐药基因序列。结果发现：(1)54株克拉霉素耐药Hp菌株的23S rRNA V区均有基因突变发生，突变位点A2143G最常见，突变率为77.8%，其他突变方式为A2174G(5.6%)、A2187G(3.7%)、A2223G(7.3%)等，见表3(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。(2)46株左氧氟沙星耐药Hp菌株的gyrA基因突变最常见的突变方式为N87K(78.3%)，其次依次为D91Y(10.9%)、A88V(6.5%)等。(3)58株甲硝唑耐药Hp菌株的rdxA基因突变以插入和缺失单核苷酸为主，最常见的突变方式为第20、32位点核苷酸插入A，产生移码突变，导致第23氨基酸(aa)序列出现终止密码子引起蛋白功能失活，突变率为44.8%。其他移码突变发生位点散布于全基因序列。

3讨论

目前国内推荐用于Hp根除治疗的抗菌药物包括：克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星、阿莫西林、呋喃唑酮和四环素[5]。本研究针对最常用的抗菌药物包括克拉霉素、左氧氟沙星和甲硝唑进行药敏检测，结果发现青岛地区仅17.9%的 Hp菌株对上述3种抗菌药物均敏感，而多重耐药菌株达29.9%，其中三重耐药菌株达9.0%。这些结果提示无药敏检测指导的随机选取抗菌药物治疗Hp感染的有效率会显著下降。不同地区Hp多重耐药率有所差异，浙江地区为23.6%[6]，上海地区高达37.8%[7]，可能与经济水平、地理分布、时间跨度及当地医生的用药习惯有一定的相关性。依据Maastricht-Ⅳ共识，基于药敏试验结果选用抗菌药物用于根除疗法仅为三线方案[8]。由于本地区多重耐药率高达近1/3而敏感菌株仅不到1/5，因此无药敏检测指导的一、二线治疗方案的效果肯定将会显著下降。据此本研究认为在多重耐药率高的地区，应在药敏检测指导下选择有效抗菌药物进行根除治疗方案，韩国的一项研究也支持本观点[9]。无药敏检测指导的三联或者四联方案不但有效率低，而且可能进一步导致抗菌药物耐药的发生。

本研究临床分离的Hp菌株双重耐药率由低到高依次为：左氧氟沙星+甲硝唑耐药率(3.0%)、克拉霉素+甲硝唑(7.5%)和克拉霉素+左氧氟沙星(10.4%)。Maastricht-Ⅳ共识推荐在克拉霉素高耐药(15%～20%)的地区，一线方案为铋剂四联疗法，二线方案为左氧氟沙星三联疗法。本地区临床分离的Hp菌株对克拉霉素耐药率为41.8%，含克拉霉素双重耐药率为18%，属于克拉霉素耐药高的地区，因此基于克拉霉素的标准三联方案不应为本地区的一线治疗方案。本地区Hp对左氧氟沙星耐药率低于克拉霉素和甲硝唑，尤其左氧氟沙星+甲硝唑双重耐药率也比较低。桂西地区的研究发现左氧氟沙星+甲硝唑双重耐药率仅1.7%，也支持这一结果[10]。因此本地区可选择含左氧氟沙星的Hp根除治疗为一线方案。

前期研究表明23S rRNA V区基因点突变导致Hp对大环内酯类抗菌药物耐药，常见突变位点为2142和2143[11]。 本研究发现A2143G突变率为77.8%，其他突变方式为A2174G(5.6%)、A2187G(3.7%)、A2223G(7.3%)等，未见2142位点突变，提示青岛地区23S rRNA基因 A2143G为克拉霉素耐药的主导因素。编码DNA螺旋酶亚单位gyrA基因的喹诺酮类耐药决定区(QRDR)基因突变可导致Hp对左氧氟沙星耐药，常见耐药位点为86～88、91[12]。本研究发现gyrA基因突变最常见的突变方式为N87K，与之前报道一致[13]。rdxA基因突变引起的酶活性丧失是Hp对甲硝唑耐药的主要因素[14]。本研究发现耐甲硝唑Hp菌株的rdxA基因第20、32位点核苷酸插入A产生移码突变，突变率为44.8%，为本地区Hp对甲硝唑耐药的主导因素。

综上所述，青岛地区Hp多重耐药率高，应根据药敏检测结果选择有效抗菌药物。左氧氟沙星可作为本地区根除治疗方案的一线用药，其临床疗效有待于进一步验证。

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·论著·

Prevalence and genetic features of multi-drug resistant Helicobacter pylori strains from Qingdao

WangLili1,2,YangChao2,DongQuanjiang2,SunGuirong1△

(1.ClinicalLaboratory,AffiliatedHosptialofQingdaoUniversity,Qingdao,Shandong266003,China;

2.CentralLaboratory,QingdaoMunicipalHospital,Qingdao,Shandong266011,China)

Abstract:ObjectiveTo analyze the single resistance and multiple resistance situation of of Helicobacter pylori (Hp) in Qingdao area to commonly used antibacterial drugs and to investigate the mutation characteristics of drug-related resistant genes.Methods Hp was isolated from the mucosal samples of gastric antrum.The agar diffusion test was used to determine the susceptibility of Hp to clarithromycin,levofloxacin and metronidazole.The 23s rRNA of clarithromycin resistance gene,gyrA of levofloxacin resistance gene and rdxA of metronidazole resistance gene were amplified by using PCR,after the PCR products sequencing,the sequence comparative analysis was performed by the ClustalW2 software.ResultsThe drug susceptibility test results found that the single resistance rates of 134 strains of clinically isolated Hp to clarithromycin,levofloxacin and metronidazole were 40.3%,34.3% and 43.3%,respectively.Only 17.9% of Hp strains were susceptible to these 3 kinds of antibacterial drug;the multi-drug resistance rate was 29.9%,triple drug resistance rate was 9.0%;furthermore,the double resistance rate of levofloxacin plus metronidazole was significantly lower than that of clarithromycin plus levofloxacin,the difference was statistically significant(3.0% vs. 10.4%,χ2= 5.96，P=0.015).The drug resistance genes sequence analyses showed that the commonest mutation locus was A2143G (77.8%),the commonest mode of gyrA gene mutation was N87K(78.3%),and which of rdxA gene was nucleotide insertion into loci 20/32,generating the frameshift mutation with the mutation rate of 44.8%.ConclusionThe multi-drug resistance rate of Hp is high in Qingdao area.The effective antibacterial drugs should be selected according to the drug susceptibility test results.Levofloxacin could serve as the first line drug for the eradication therapy scheme in this area.

Key words:Helicobacter pylori;clarithromycin;levofloxacin;metronidazole;resistance

收稿日期：(2015-08-16)

文献标识码：

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.24.032A

文章编号：1673-4130(2015)24-3583-03