多疣壁虎纤维连接蛋白在壁虎脊髓断尾再生中的表达变化及作用

宋红花， 王勇军， 吴尤佳， 孙宝兰

1.南通大学附属医院小儿内科, 南通 226001 2.南通大学神经再生重点实验室, 南通 226001

论 著

多疣壁虎纤维连接蛋白在壁虎脊髓断尾再生中的表达变化及作用

宋红花1， 王勇军2*， 吴尤佳1， 孙宝兰1

1.南通大学附属医院小儿内科, 南通 226001 2.南通大学神经再生重点实验室, 南通 226001

目的：通过研究多疣壁虎纤维连接蛋白(fibronectin, FN)在多疣壁虎断尾再生过程中的表达变化及其对Gsn3增殖、迁移和细胞突起生长的影响，初步探讨FN在脊髓再生中的作用及可能机制。方法：应用简并PCR技术从多疣壁虎组织中获得FN的一段特异性EST序列。采用实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reation, qRT-PCR)技术检测壁虎断尾损伤脊髓中FN mRNA的变化。用体外人源FN蛋白培养壁虎少突胶质细胞系Gsn3细胞，DiI染色观察FN对Gsn3细胞形态及增殖的影响；Transwell技术检测FN对Gsn3细胞迁移的影响。结果：在壁虎断尾损伤后再生脊髓远侧端，FN mRNA表达急剧上调，在断尾后1 d表达最高，随着时间延长逐渐下降。在体外，人源FN促进壁虎Gsn3细胞增殖和迁移，但不能使细胞突起伸长。结论：FN可能通过促进少突胶质细胞的增殖和迁移参与壁虎断尾后脊髓的再生。

纤维连接蛋白；再生；Gsn3细胞；增殖；迁移

高等动物中枢神经损伤后的再生与功能恢复一直是神经科学研究领域的热点与难点。中枢神经系统损伤后再生失败是由于不能激活神经元生长能力，且周围环境中存在生长抑制因子及缺少营养支持[1]。纤维连接蛋白(fibronectin, FN)是一种重要的营养因子，是胞外基质复合物的重要组成成分。FN至少是11种不同整联蛋白异二聚体的配体，促进细胞的黏附[2]。大量研究表明，FN参与多种组织的损伤和修复。成体高等动物中枢神经系统损伤后不能再生，而低等动物却具有很强的再生能力，如多疣壁虎脊髓损伤后能够进行自我修复与再生。胞外基质中的FN是否参与壁虎脊髓的再生过程的相关研究较少。壁虎少突胶质细胞Gsn3由Liu等[3]于2012年首次构建。此后的研究[4-5]发现，壁虎Gsn3参与了壁虎脊髓损伤的再生，如壁虎断尾再生过程中，糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β) 的下调促进少突胶质细胞突起的生长，从而参与损伤脊髓的再生。

本研究通过建立壁虎脊髓损伤模型，初步探讨FN在脊髓再生过程中的表达变化及其对Gsn3细胞的影响，为后续深入研究FN参与神经再生的机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料及试剂 成年多疣壁虎(Gekko japonicus)雌雄各5只，大小均一，体质量为(3.0±0.5) g，体长为(5.7±0.2) cm，由南通大学实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。TRIzol试剂、反转录试剂盒购自Invitrogen公司，DMEM/F12、DMEM、FBS购自Gibco公司，人源FN购自Sigma公司、DiI 染色液购自Sigma公司、Transwell 购自BD公司、ExTaqDNA聚合酶购自TaKaRa公司。

1.2 方 法

1.2.1 简并PCR获得FN特异性EST序列 用TRIzol试剂提取壁虎组织的总RNA，用反转录试剂盒合成cDNA第1链。根据其他各物种蛋白质的同源性，设计FN的简并引物：上游引物 5′-CGG CGG GAC AAC ATG aart ggt gyg g-3′，下游引物 5′-CGA TGC CCC TGC CGt arc art arc a-3′。用简并PCR扩增特异性EST序列。将此序列测序后与NCBI上的其他序列进行比对。

1.2.2 Real-time PCR检测FN mRNA 在多疣壁虎断尾再生中的表达变化 以扩增出的EST序列为模板，用Primer 5软件设计引物。其中上游引物5′-GAC AAG CAG CAC GAC ATG G-3′，下游引物5′-CCC TTC TTC GTG GCG TTT-3′。用TRIzol提取壁虎断尾0 d、1 d、3 d、1周、2周脊髓下段的总RNA，并反转录为cDNA第1链。qRT-PCR反应体系如下：SuperMix-UDG with ROX 12.5 μL、上游和下游引物各0.5 μL、模板 1 μL、 ddH2O 10.5 μL。 反应程序如下：93℃ 2 min，93℃ 30 s，62℃ 30 s；共40个循环。以真核生物延伸因子基因1α(eukaryotic elongation factor-1α，EF-1α)为内参基因。

1.2.3 壁虎Gsn3细胞克隆株的培养及FN处理 Gsn3细胞于30℃、5% CO2条件下，在含1% 双抗、10% FBS的DMEM/F12的培养基中培养。培养2 d 后，细胞融合度达80%，用胰酶消化片刻后重悬，进行传代扩增。用购买的人源FN以2 μg/cm2铺皿培养壁虎Gsn3细胞，2 d后用DiI染色，显微镜下观察细胞形态，并随机选取5个视野，拍照并统计。

1.2.4 Transwell检测Gsn3细胞迁移情况 制备Gsn3细胞悬液，调整细胞密度至3×105个/mL。取细胞悬液100 μL加入Transwell小室。24孔板下室加入含30 μg/mL FN的完全培养基。细胞常规培养2 d，用无钙PBS洗2次，甲醇固定30 min后，将小室适当风干。用0.1%结晶紫染色20 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3次。显微镜下随机选择5个视野观察细胞，计数。

2 结 果

2.1 FN在多疣壁虎断尾脊髓再生过程中的表达变化 将简并PCR扩增得到的EST序列与NCBI上的其他序列进行比对，结果显示，此序列与其他物种FN基因的高度同源。以此EST序列为模板设计qRT-PCR引物，对脊髓再生过程中FN的表达进行检测。结果显示：以EF-1α基因作为参照，断尾损伤后，FN mRNA表达上调，断尾后1 d FN的转录水平达最高，然后逐渐下降(P<0.01，图1)。

2.2 人源FN对壁虎Gsn3细胞增殖的影响 用人源FN蛋白(2 μg/cm2)铺皿培养Gsn3细胞2 d后，DiI染色结果显示，FN处理后细胞的数量明显增多(P<0.05，图2)。

2.3 人源FN对壁虎Gsn3细胞突起生长的影响 人源FN蛋白(2 μg/cm2)铺皿培养Gsn3细胞2 d后，DiI染色结果显示，FN蛋白处理细胞的突起长度与对照组差异比较，无统计学意义(图3)。

2.4 人源FN对壁虎Gsn3细胞迁移的影响 人源FN蛋白(2 μg/cm2)铺皿培养Gsn3细胞2 d后甲醛固定，结晶紫染色结果显示，FN处理细胞的迁移数量较对照组明显增多(P<0.01，图4)。

图2 人源FN对壁虎Gsn3细胞增殖的影响Orignial magnification: ×10.*P<0.05与control组比较; n=3,

图3 FN对Gsn3细胞突起生长的影响Orignial magnification: ×20.n=3,

图4 FN对Gsn3细胞迁移的影响Orignial magnification: ×20.**P<0.01与control组比较；n=3,

3 讨 论

壁虎是一种再生能力很强的脊椎动物，断尾后能够再生出原有的尾部结构，其中包括脊髓的再生。由于壁虎在进化上更加接近高等动物，因此其断尾损伤模型成为研究高等动物中枢神经再生的良好模型。通过对壁虎断尾再生机制的研究，能为人类神经系统的损伤修复研究提供线索。多疣壁虎断尾损伤后，首先是断尾处愈伤上皮再生，然后是顶端复层上皮帽状结构(AEC)形成，接着是芽基的形成和尾部延伸。在壁虎脊髓损伤再生过程中，有多种营养因子和信号调节分子参与其中。

FN是一种高分子糖蛋白，广泛存在于细胞表面、细胞外液、基膜和结缔组织，是细胞外基质的重要组成部分。FN参与细胞多种生理功能，包括调节细胞的增殖、分化、迁移和聚集等。FN在机体内的分布和含量与肿瘤的发生、发展有着密切联系。FN可直接影响肿瘤的生物学行为，如促进癌症细胞的增殖、侵袭和转移等[6-7]。FN除在癌症中发挥重要作用外，还参与机体的创伤修复和再生过程。FN是肌肉源性干细胞的优先附着底物，老年小鼠骨骼肌干细胞龛中FN水平的降低会损害肌肉源性干细胞的功能和骨骼肌的再生能力[8]。中性粒细胞合成的FN对骨折愈合有明显的促进作用[9]。此外，FN作为细胞外基质成分，参与伤口的愈合与皮肤的再生[10]。本研究发现，断尾损伤后FN mRNA表达上调，断尾后第1天达最高，然后逐渐下降，但在脊髓再生过程中持续高表达。这一结果与上述研究中FN参与组织损伤修复的结果相一致。FN在脊髓损伤的第1天表达最高，可能是因为机体受到断尾损伤后发生应激反应，从而大量分泌FN，促进伤口的愈合和愈伤上皮的形成。愈伤上皮形成以后，后续部分的再生关键是神经细胞的修复和再生。大量研究[11-12]表明，FN支持中枢神经系统中神经元突起的萌发与轴突的再生。研究[13]也表明，间充质干细胞分泌的FN在体外诱导神经突起的生长和促进神经纤维的再生。因此，可以初步断定FN参与了壁虎神经系统的损伤修复。

在神经系统中，少突胶质细胞扮演了重要的角色。少突胶质细胞在髓鞘形成和神经电信号的传递过程中起重要作用，同时能维持和保护神经元的正常功能。所以本实验选择壁虎少突胶质细胞作为体外研究对象。本研究采用人源FN培养Gsn3细胞的主要原因有3个：第一，由于现阶段还没有商品化的壁虎FN蛋白，其来源受到限制；第二， FN基因及其功能在进化过程中保守性很高，因此可以采用人源FN，若异源性FN对Gsn3细胞有作用，那么可以间接表明同源性FN对Gsn3细胞的作用；第三，我们研究的最终目的是为人类的脊髓损伤再生提供实验基础。

综上所述，本研究中，FN在多疣壁虎断尾脊髓再生过程中的表达增加；FN体外培养壁虎Gsn3细胞能促进细胞的增殖和迁移。这提示壁虎在脊髓损伤后大量神经细胞死亡的情况下，FN可促进少突胶质细胞迁移到受损部位并大量增殖，参与髓鞘形成和保护受损的神经元。因此认为，少突胶质细胞替代疗法是治疗脊髓损伤的一个潜在的有效策略。FN在中枢神经系统损伤和修复中的作用及机制还有待进一步深入研究。

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[本文编辑] 姬静芳

Effect and expression changes of fibronectin on spinal cord regeneration of Gekko japonicus

SONG Hong-hua1, WANG Yong-jun2*, WU You-jia1, SUN Bao-lan1

1.Department of Pediatrics, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu, China 2.Key Laboratory of Neuroregeneration, Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu, China

Objective：To observe expression changes of fibronectin (FN) and its effect on Gsn3 proliferation, migration and oligodendrocyte of spinal cord regeneration of Gekko japonicus, and also analyze the effects and possible mechanism of FN involved in spinal cord regeneration.Methods：Using degenerate PCR to obtain a special EST sequence of FN from Gekko japonicus tissue.The expression changes of FN mRNA in the regenerating spinal cord after tail amputation were detected by real-time quantitative polymerase chain reation (qRT-PCR).In vitro, the human FN was used to culture Gekko oligodendrocyte cell line (Gsn3 cells).The morphology and proliferation of Gsn3 cells after FN treatment were also observed by DiI staining, whereas the migration was detected by Transwell.Results：During the Gekko spinal cord regeneration, FN mRNA expression is significantly increased at 1 dpa (1-day post amputation) then decreased gradually with the time extension in distant spinal cord.FN is able to promote the proliferation and migration of Gsn3 cells, but could not promote the extension of process in vitro.Conclusions：FN participates in spinal cord regeneration by affecting oligodendrocyte proliferation and migration.

fibronectin; regeneration; Gsn3 cells; proliferation; migration

2016-07-22[接受日期]2016-12-14

国家自然科学基金(31471011).Supported by National Natural Science Foudation of China (31471011).

宋红花，硕士，研究实习员.E-mail: song_hong_hua@126.com

*通信作者(Corresponding author).Tel: 0513-85051818, E-mail: wyjbs@ntu.edu.cn

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160751

R 322.8

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