地塞米松对兔眼水通道蛋白-1表达的影响及其与眼压的关系

杜静　刘苏

地塞米松对兔眼水通道蛋白-1表达的影响及其与眼压的关系

杜静1刘苏2

目的 研究地塞米松（DEX）对兔眼小梁内皮细胞（TM）和睫状体无色素上皮（NPCE）细胞水通道蛋白-1（AQP1）表达的影响。方法 建立兔皮质类固醇性高眼压模型，用免疫组化和免疫荧光方法检测高眼压组与正常对照组AQP1表达水平的差异。结果 实验组兔眼NPCE的AQP1表达比正常对照组增强（P＜0.05），而在TM细胞则减弱（P＜0.05）。结论 地塞米松能使兔眼眼压升高，可能是通过抑制AQP1在TM的表达，并使NPCE的AQP1表达上调，这可能是皮质类固醇性青光眼的病理机制之一。

地塞米松；睫状体无色素上皮细胞；小梁细胞；水通道蛋白-1；青光眼

1　引言

水通道蛋白（aquaporins，AQPs）是一类广泛存在于哺乳动物体内细胞膜或细胞内囊泡中的水分子跨膜转运蛋白，目前在眼组织中发现有5种AQP亚型［1-2］，与眼内液体转运和眼功能的维持密切相关。目前皮质类固醇性青光眼（corticosteroid glaucoma）的发病机制不明确，但睫状体房水产生过多或者小梁网房水流出障碍引起的眼内压的升高是公认的主要危险因素［3］。AQP家族的发现，为房水动力学开启了新的研究领域。

2　材料与方法

2.1主要试剂及实验动物

地塞米松磷酸钠（Sigma），鼠抗兔AQP1多克隆抗体（ADI，免疫组化一抗），山羊抗鼠IgG（Sigma，免疫组化二抗），Cy3荧光标记羊抗鼠IgG（Sigma，免疫荧光二抗），SABC免疫组化试剂盒（中杉）。8周龄健康新西兰大白兔30只。

2.2实验方法

2.2.1兔激素性高眼压模型的建立 采用随机数字法将30只兔分为两组：实验组（20只）和正常对照组（10只）。处理前用Schiotz眼压计测量兔眼压［4］，然后用1%地塞米松磷酸钠溶液［5］滴实验组双眼，用无菌生理盐水滴对照组双眼，连续3周，监测眼压。眼压成功升高的实验组兔再随机分为DEX组（10只）和观察组（9只，死亡1只）。DEX组立即取下眼球标本固定，观察组继续监测眼压6周，最后取下眼球标本固定、包埋、切片。

2.2.2免疫组织化学（SABC法）和免疫荧光 石蜡片经常规处理及免疫组化、免疫荧光方法处理，拍照采集图片。阴性对照用PBS缓冲液代替一抗。最后采集图片用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件定量分析免疫组化染色的阳性光密度值。

2.3统计学方法

DEX作用前后眼内压数据用自身配对t检验方法。正常对照组、DEX组和观察组之间免疫组化的光密度值（OD）的比较用多个样本均数间比较的SNK法单因素方差分析。统计学资料用SPSS 19.0软件进行分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

3　结果

3.1眼压

用1%地塞米松磷酸钠溶液滴眼可以成功建立兔皮质类固醇性高眼压模型，成功率95%（P＜0.05）。用药前兔眼基础眼压为（35.591±2.513 1）mm Hg，实验组用药后第13～19 d时达高峰，约（50.5±3.829 7）mm Hg，观察组眼压在停药8周后基本降到用药前水平。

3.2组织病理学改变

3.2.1免疫荧光切片 AQP1在正常兔眼角膜内皮和虹膜后色素上皮、睫状体无色素上皮、小梁内皮等多处表达。Cy3荧光成亮红色，表达部位在阳性细胞的胞膜。

3.2.2免疫组化切片 AQP1的表达在组织切片上表现为阳性细胞膜上的棕褐色颗粒。AQP1在DEX组NPCE的表达（0.365±0.112）较对照组（0.276±0.077）增强（P＜0.05），在观察组（0.280±0.086）则恢复到正常水平。AQP1在DEX组TM的表达（0.164±0.085）较对照组减弱（0.265±0.056）（P＜0.05），阳性细胞数量也减少，观察组（0.181±0.066）与DEX组的情况接近、尚未恢复。

4　讨论

Bogner B［2］等研究发现并定位了兔眼内5个AQPs亚型。在胎鼠发育过程中AQP1表达在NPCE以及虹膜后上皮层，提示其与房水的分泌有关［6］。本实验发现AQP1在兔眼TM和Schlemm管以及NPCE的内皮表达，可以看出这种分布与眼内房水的分泌和流出密切相关。Zhang等［7］进一步研究发现AQP1基因敲除鼠的房水生成明显减少，眼压下降，因此AQP1被证实参与了睫状体房水的分泌过程。那么本实验发现DEX使兔眼NPCE的AQP1表达上调，房水分泌增加，可以认为是激素性高眼压的原因之一。

另一方面本实验还发现DEX抑制兔眼小梁组织AQP1的表达，同样地塞米松也抑制体外培养的人眼小梁细胞［8］AQP1的表达。AQP1在小梁和Schlemm管内皮细胞的作用还不得而知，而房水的外流主要是通过细胞外途径还是跨细胞途径，地塞米松对房水外流阻力有哪些影响等，都有待进一步研究。

综上所述，DEX诱导兔眼压升高，可能是通过上调睫状体无色素上皮AQP1的表达，增加房水生成，同时抑制小梁组织AQP1表达，同时小梁细胞减少，细胞外基质堆积，房水排出受阻。两方面综合作用，导致激素性青光眼的发生。

［1］Verman AS. Role of aquaporin water channels in eye function［J］. Exp Eye Res，2003，76（2）：137-143.

［2］Bogner B，Schroedl F，Trost A，et al. Aquaporin expression and localization in the rabbit eye［J］. Exp Eye Res.，2016，147：20-30.

［3］Knepper PA，Goossens W，Hvizd M，et al. Glycosaminoglycans of the human trabecular meshwork in primary open-angle glaucoma［J］. Invest Ophthalmol Vis Sci.，1996，37（7）：1360-1367.

［4］Best M，Pola R，Galin MA，et al. Tonometric calibration for the rabbit eye［J］. Arch Ophthalmol，1970，84（2）：200-205.

［5］Levene RZ，Rothberger M，Rosenberg S. Corticosteroid glaucoma in the rabbit［J］. Am J Ophthalmol，1974 ，78（3）：505-510.

［6］Yamaguchi Y，Watanabe T，Hirakata A，et al. Localization and ontogeny of aquaporin-1 and -4 expression in iris and ciliary epithelial cells in rats［J］. Cell Tissue Res.，2006，325（1）：101-109.

［7］Zhang D，Vetrivel L，Verkman AS. Aquaporin deletion in mice reduces intraocular pressure and aqueous fluid production［J］. Gen Physiol.，2002，119（6）：561-569.

［8］林明楷，葛坚，黄楚龙，等. 地塞米松对人眼小梁细胞水通道蛋白-1表达的影响［J］. 中国药房，2002，13（12）：713-714.

Effects of Dexamethasone on Expression of Aquaporin-1 in Rabbit Eye and the Correlation to Intraocular Pressure

DU Jing1LIU Su21 Department of Ophthalmology， Chongqing Aier Eye Hospital， Chongqing 400000， China， 2 Department of Ophthalmology， The Second Affliated Hospital of Chongqing University of Medical Sciences，Chongqing 400010， China

Objective To study the effects of dexamethasone （DEX）on expression of aquaporin-1 （AQP1） in rabbit eye's trabecular meshwork （TM） and non-pigmented ciliary epithelium （NPCE） cells. Methods To establish a rabbit model of high intraocular pressure induced by corticosteroids， and to detect the difference of AQP1 expression between high intraocular pressure group and normal control group by immunohistochemistry and immunofluorescence method. Results The expression of AQP1 of NPCE in the experimental group was stronger than that in the normal control group （P＜0.05）， while the TM cells were decreased （P＜0.05）. Conclusion Dexamethasone can increase the intraocular pressure of the rabbit eyes， may be throughinhibiting the expression of AQP1 in TM， and make AQP1 of NPCE expression up regulation， which may be one of the pathological mechanisms of corticosteroid glaucoma.

Dexamethasone， Non-pigmented ciliary epithelium，Trabecular meshwork， Aquaporin-1， Glaucoma

R775

A

1674-9308（2016）22-0212-02

10.3969/j.issn.1674-9308.2016.22.140

1重庆爱尔眼科医院眼科，重庆 400000；2 重庆医科大学附属第二医院眼科，重庆 400010

刘苏，E-mail：liusu2836@sina.com