光照强度及盐浓度对杜氏盐藻生长及β-胡萝卜素积累的影响*

刘　真，刘姗姗，张玉洁，朱相展，张彦婷，李庆华，马珊珊，张　琨，关方霞

1)郑州大学生命科学学院 郑州 450001　2)郑州大学第一附属医院干细胞实验室 郑州 450052



光照强度及盐浓度对杜氏盐藻生长及β-胡萝卜素积累的影响*

刘真1)，刘姗姗1)，张玉洁1)，朱相展1)，张彦婷1)，李庆华1)，马珊珊1)，张琨1)，关方霞1,2)#

1)郑州大学生命科学学院 郑州 4500012)郑州大学第一附属医院干细胞实验室 郑州 450052

关键词杜氏盐藻；β-胡萝卜素

摘要目的：探讨光照强度和盐浓度对杜氏盐藻生长和细胞内β-胡萝卜素积累的影响。方法：检测正常培养条件下杜氏盐藻生长情况和β-胡萝卜素变化，不同浓度(0.5、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mol/L)NaCl培养后细胞内β-胡萝卜素的积累情况。采用高光(5 000～6 000 Lux)、高盐(3.5 mol/L NaCl)及高光高盐条件对培养至对数生长末期的杜氏盐藻进行β-胡萝卜素积累的诱导。结果：正常条件下杜氏盐藻培养2 周后进入稳定期，细胞内β-胡萝卜素含量呈先下降后上升趋势，第9 天达到最大值，随后出现小幅度波动；杜氏盐藻细胞内β-胡萝卜素含量随NaCl浓度升高而升高，二者呈正相关(r=0.969，P<0.001)。与正常条件相比，高光、高盐单独作用均能够提高细胞内β-胡萝卜素含量，而高光高盐联合作用最有利于杜氏盐藻细胞β-胡萝卜素的积累。结论：高光高盐联合作用可作为杜氏盐藻细胞内β-胡萝卜素的最佳诱导条件。

AbstractAim: To study the effects of light and salt concentration on the growth of Dunaliella salina and intracellular accumulation of β-carotene. Methods: The growth of Dunaliella salina and change of β-carotene content were measured under normal culture conditions. And the accumulation of β-carotene under different salt concentrations(0.5，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mol/L) was detected. Then high-light(5 000-6 000 Lux), high-salt(3.5 mol/L NaCl) and high-light plus high-salt conditions were used to induce β-carotene accumulation. Results: Under normal conditions, Dunaliella salina grew to the stable phase after 2 weeks of cultivation,the intracellular β-carotene content was decreased at first and then increased,on the 9th day the content reached a maximum followed by a slight fluctuation. The β-carotene content of cells increased with increasing salt concentration, indicating that the two indexes were positively correlated(r=0.969，P<0.001). Furthermore, the results of induction experiments showed that the β-carotene content increased in both high-light and high-salt conditions, compared with normal conditions. And the combination of high-salt and high-light was most favorable to β-carotene accumulation. Conclusion: The combined high-light and high-salt might be the optimal induction conditions for β-carotene accumulation in Dunaliella salina,which provides a theoretical basis for the industrial production of Dunaliella salina.

杜氏盐藻是一种极具经济价值的单细胞真核绿藻[1-2]，它主要分布在海洋、盐湖等盐水水体中[3]，是目前世界上最耐盐的真核光合生物[4]。在一定条件下，β-胡萝卜素含量可高达杜氏盐藻细胞干重的10%左右[5]，因而杜氏盐藻是目前公认的商业化生产天然β-胡萝卜素的理想资源。β-胡萝卜素是一种亲脂性的高价值化合物[6]，作为着色剂、抗氧化剂和抗衰老剂，被广泛应用在食品、化妆品和制药工业[7-9]。β-胡萝卜素具有清除氧自由基的能力[10]，是维护人体健康不可缺少的营养物质，在抗癌、预防心血管疾病、白内障及抗氧化方面具有显著的作用，可防止老化和衰老引起的多种退化性疾病[11-12]。目前，包括美国、以色列、澳大利亚、印度等在内的许多国家都相继开展了大规模盐藻β-胡萝卜素生产特性研究，并已进入商业化生产[13-15]。我国具有漫长的海岸线和许多内陆盐湖，具有培养杜氏盐藻，生产β-胡萝卜素的得天独厚的自然条件。该研究以杜氏盐藻UTEX-1644为对象，通过观察杜氏盐藻在正常条件和不同盐浓度培养过程中β-胡萝卜素含量的变化，并比较高光、高盐及高光高盐3种胁迫条件下β-胡萝卜素的积累情况，探讨杜氏盐藻β-胡萝卜素的积累规律，从而确定β-胡萝卜素积累的最佳条件，为建立高产β-胡萝卜素的杜氏盐藻提供理论依据。

1材料与方法

1.1藻种与主要试剂杜氏盐藻藻株为UTEX-1644，购自美国Texas大学。NaCl、KNO3、MgSO4、KH2PO4、FeCl3、CaCl2、丙醇等均为国产分析纯。

1.2杜氏盐藻培养杜氏盐藻培养使用UTEX-1644液体培养基，培养基组成包括：NaCl 1.5 mol/L，KNO350 mmol/L，MgSO42 μmol/L，KH2PO45 mmol/L，FeCl36 μmol/L，CaCl25 mmol/L，微量元素母液。通过调节NaCl含量改变培养基盐浓度。配制完成后进行高压蒸汽灭菌(121 ℃、30 min)，完成后待其冷却，用0.1 mol/L的NaHCO3调pH至7.5左右。培养条件：取对数生长期杜氏盐藻接种于含有100 mL UTEX-1644培养基的250 mL三角瓶中，置于光照培养箱进行培养，温度25.7 ℃，光暗比12 h12 h，光照强度3 000～4 000 Lux，每天振荡2次。

1.3不同NaCl浓度对杜氏盐藻细胞β-胡萝卜素含量的影响将杜氏盐藻于含不同浓度(0.5、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mol/L)NaCl的UTEX-1644培养基中培养14 d，于对数生长期末收集并检测杜氏盐藻细胞中β-胡萝卜素的含量。

1.4胁迫条件下诱导β-胡萝卜素积累杜氏盐藻藻液一部分分装于250 mL培养瓶中，每瓶100 mL，分别在正常条件(光强3 000～4 000 Lux，NaCl 1.5 mol/L)、高光培养条件(光强5 000～6 000 Lux，NaCl 1.5 mol/L)下诱导β-胡萝卜素的积累；另一部分离心，重悬后分装于含有100 mL UTEX-1644液体培养基的250 mL培养瓶中，分别在正常条件(光强3 000～4 000 Lux，NaCl 1.5 mol/L)、高盐培养条件(光强3 000～4 000 Lux，NaCl 3.5 mol/L)及高光高盐条件(光强5 000～6 000 Lux，NaCl 3.5 mol/L)下诱导β-胡萝卜素的积累，每组重复3次。

1.5盐藻细胞密度的测定取1 mL藻液，加入0.2 mL甲醛固定，血细胞计数板进行细胞计数，重复3次。同时，测定同一样品在750 nm处的吸光度，重复3次。以光密度(OD750 nm)值为横坐标、藻细胞密度为纵坐标绘制细胞密度-光密度标准曲线。

1.6β-胡萝卜素含量的测定取1.5 mL藻液离心去上清，加入体积分数80%的丙酮，使藻体充分溶解在丙酮液体中，黑暗环境下静置5 min，离心，使沉淀呈灰白色，测定上清450 nm处吸光度(A450 nm)值。根据Jensen公式[16]换算出每个细胞中β-胡萝卜素的含量。

2结果

2.1杜氏盐藻细胞密度与光密度关系见图1，杜氏盐藻的细胞密度与OD750 nm具有较好的线性关系。

图1　杜氏盐藻细胞密度与光密度(OD750 nm)值关系

2.2杜氏盐藻在正常条件下的生长情况及β-胡萝卜素含量变化正常条件下培养，盐藻细胞在接种后的5 d左右进入对数生长期，可维持1周左右;在第14天左右达到对数生长末期，之后进入稳定期(图2)。培养初期每细胞内β-胡萝卜素含量骤减，随后逐渐增加，在第9 天达到最大值，之后随着培养时间的延长呈小幅度波动(图3)。

图2　正常条件下杜氏盐藻的生长曲线

图3　正常条件下杜氏盐藻细胞中β-胡萝卜素的含量变化

2.3杜氏盐藻在不同NaCl浓度下β-胡萝卜素的积累变化随着盐浓度的升高，单个细胞中β-胡萝卜素含量不断增加，二者呈正相关(r=0.969,P<0.001)。

2.4杜氏盐藻在诱导环境下β-胡萝卜素的积累情况将培养至对数生长末期的杜氏盐藻细胞分别转入高光、高盐、高光高盐三种条件下进行诱导，细胞内β-胡萝卜素含量见图4。结果显示，转入高光诱导条件下，细胞内β-胡萝卜素含量迅速增加，3 h时达到最大值，随后逐渐下降至正常水平。正常培养下细胞内β-胡萝卜素含量增幅较小。转入高盐和高光高盐诱导条件后，由于离心和更换新鲜培养基，为适应细胞损伤和新环境，在更换培养基3 h内，细胞内β-胡萝卜素含量下降，随后大幅增加，9 h后趋势变缓，高光高盐诱导效果明显，β-胡萝卜素含量明显高于对照组。高光、高盐单独作用均能促进细胞中β-胡萝卜素的积累，且二者联合作用效果更为显著。

图4　不同诱导环境下杜氏盐藻细胞中β-胡萝卜素的含量

3讨论

β-胡萝卜素作为微生素A原，是联合国粮农组织和世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会认定的A类营养食品强化剂。作为药物，β-胡萝卜素已被美国药典、欧洲药典和英国药典正式收载。β-胡萝卜素可降低人癌症发生率[17]。国内外大量研究[18]证实，β-胡萝卜素能够抑制肿瘤形成，具有抗辐射和抵抗某些化学物质致癌的作用。因其具有较好的淬灭单线态氧清除自由基抑制脂质过氧化作用，可用于预防和治疗心血管疾病、白内障等多种衰老引起的退化性疾病[19]。

杜氏盐藻中β-胡萝卜素是光合作用的捕光辅助色素，并能保护光合作用的反应器不受光抑制[20]。当杜氏盐藻处于某种不利生长的条件(即胁迫条件)下，就会出现乙酰辅酶A的积累并导致β-胡萝卜素的合成和积累。在适当条件下，杜氏盐藻细胞中β-胡萝卜素含量可达细胞干重的10%(质量分数)[5]。因此，杜氏盐藻是天然β-胡萝卜素的理想来源。

该研究结果表明，在正常培养条件下，细胞中能够积累少量β-胡萝卜素，且盐藻生长和β-胡萝卜素累积存在一定关系，当细胞快速生长时，β-胡萝卜素的累积较少，而当细胞生长缓慢或生长受到抑制时，β-胡萝卜素开始大量累积。此外，提高培养基中盐浓度，能够显著影响细胞中β-胡萝卜素的积累，二者呈正相关。说明高盐胁迫有利于藻细胞积累β-胡萝卜素，然而高盐条件下藻细胞生长受到明显抑制。实践中，为提高杜氏盐藻β-胡萝卜素产量，需要同时满足两方面条件，一是获得较高的生物量，二是提高单位细胞内β-胡萝卜素含量。因此，作者选择在杜氏盐藻正常培养至对数生长末期，得到较高藻细胞密度后，将细胞转入胁迫条件下，诱导细胞中β-胡萝卜素的积累。该研究结果表明，对数生长末期的藻细胞转入不同条件下诱导后， 高光、高盐均能够明显提高细胞中β-胡萝卜素含量，且二者共同作用时效果更为显著。已有研究[20-21]表明，β-胡萝卜素在光氧化过程中具有清除氧自由基的能力，它能保护光系统免受光氧化的破坏，同时其含量与光合效率指数负相关，因此提高光强能够有效促进细胞内β-胡萝卜素的积累。此外，有研究[21]表明，高盐胁迫过程中细胞内能够检测到一种大小约15 000的蛋白的表达，该蛋白参与β-胡萝卜素合成，但具体作用和机制尚不清楚。同时，该研究结果显示，相比于高盐诱导，高光作用能够在较短时间内对β-胡萝卜素的积累发挥明显的促进效果。

综上所述，通过观察不同培养条件及不同诱导条件对杜氏盐藻细胞内β-胡萝卜素积累的影响，初步确定以高光高盐联合作用作为其最佳诱导条件，从而为建立高产β-胡萝卜素的杜氏盐藻培养体系提供实验依据。

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*大学生创新创业训练计划项目201410459052

Effects of light intensity and salt concentration on growth of Dunaliella salina and accumulation of β-carotene

LIUZhen1),LIUShanshan1),ZHANGYujie1),ZHUXiangzhan1),ZHANGYanting1),LIQinghua1),MAShanshan1),ZHANGKun1),GUANFangxia1,2)

1)CollegeofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)StemCellLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsDunaliella salina;β-carotene

中图分类号Q945.1

通信作者#，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向：生物医学，E-mail:guanfangxia@126.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.008