LC-MS-MS法同时测定动物肌肉组织和牛奶中10种氨基糖苷类药物的方法优化研究

叶磊海，钟世欢，叶佳明，杨 琳，许荣年

（1.浙江公正检验中心有限公司，浙江杭州 310009；2.浙江赞宇科技集团股份有限公司，浙江杭州 310009）

LC-MS-MS法同时测定动物肌肉组织和牛奶中10种氨基糖苷类药物的方法优化研究

叶磊海1，钟世欢1，叶佳明1，杨 琳1，许荣年2

（1.浙江公正检验中心有限公司，浙江杭州 310009；2.浙江赞宇科技集团股份有限公司，浙江杭州 310009）

应用高效液相色谱-串联质谱法，建立了动物肌肉组织和牛奶中壮观霉素、潮霉素B、链霉素、双氢链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、安谱霉素、妥布霉素、新霉素、庆大霉素10种氨基糖苷类药物的的检测方法。样品通过三氯乙酸提取并沉淀蛋白，用HLB固相萃取柱净化，通过SILICA SG80 S5色谱柱分离，在正离子多反应监测模式下分析定量。在0.02～1μg/mL的浓度范围内线性良好，相关系数大于0.995，在100、200、300μg/kg 添加水平下，平均回收率为70%～110%，相对标准偏差均小于15%，检测限为20μg/kg。该方法简单，快速，准确，同时避免七氟丁酸等离子对试剂对仪器造成的污染及离子抑制问题。

高效液相色谱-串联质谱；氨基糖苷类药物；动物肌肉组织和牛奶

氨基糖苷类抗生素是一类含有氨基糖苷键的抗生素，抗菌谱广，对需氧革兰阴性杆菌具有强大的抗菌活性，临床应用广泛，目前已有数十种天然抗生素或半合成品种，由于其高效低价，是当今世界使用最为普遍的抗生素种类之一，广泛用于养殖业中。然而由于其具有耳肾等毒副作用，同时伴随着大量应用这类抗生素而出现临床耐药菌。我国卫生部、农业部，质检总局以及相关部门也将其列为监管工作中的重点，为此，建立简单、可靠、快速、灵敏的检测方法对于保证动物源食品安全，促进养殖业的健康发展，具有十分重要的意义。

目前国内外检测此类抗生素的方法主要有微生物法[1]、免疫分析法[2]、气相色谱法和质谱法，液质联用法是目前检测此类抗生素最广泛的的方法[3]。但是由于氨基糖苷类药物易溶于水，极性很强，在C18柱上保留很弱，且无紫外吸收，目前使用最多的是通过加入离子对试剂增强保留，动物源食品基质复杂，给目标物的定性和定量检测带来很大的难度，目前文献报道的方法前处理步骤繁琐，整个检测周期长，基质效应较为严重[4]，很难获得良好的峰型和分离。

本方法通过改变前处理方式，优化质谱条件，能够缩短检测时间，有效去除不同基质样品带来的基质效应，同时避免七氟丁酸等离子对试剂对仪器造成的污染及离子抑制问题。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent6460液相色谱串联三重四级杆质谱仪，配有电喷雾（ESI）离子源（美国 Agilent公司）AR2140电子分析天平，KS-300EI超声波清洗器（宁波海曙科生超声设备公司）、Centrifug-5804R台式离心机（德国 Eppendorf），N-EVAP 11氮吹仪（美国Organomation associates Inc），milli-Q纯水仪（美国millpore公司）chunGX-274固相萃取装置，Oasis HLB SPE（3cc/6mg，美国 Waters）。

乙腈，色谱纯。甲酸，色谱纯。三氯乙酸：纯度≥99%。

10种标准品（纯度90.0%～100%）：Dr.Ehrenstorfer德国。

分别称取10mg氨基糖苷类药物标准品，用水溶解，配置成浓度为100μg/mL的标准储备液，于-18℃避光保存。用空白基质样品配置成不同浓度系列的混合标准工作溶液（现配现用）。

1.2 实验条件

1.2.1 样品前处理

称取样品约5.00g（精确至1 mg），置于50.0mL离心管中，加入10.0mL5%三氯乙酸，涡旋30s，超声提取15min，10 000r/min离心，1min，倒出上清液于50mL离心管，残渣重复提取一遍，合并上清液，备用。

净化：分别用3.0mL甲醇，3mL水，3mL5%三氯乙酸淋洗后，准确将20mL提取液放入小柱，先用5mL水溶液淋洗，再用6mL甲醇洗脱，收集洗脱液于试管中，氮吹至近干，用0.1%甲酸乙腈（3+7）定容至1.0mL，漩涡混匀，过0.22μm微孔滤膜，液相色谱-质谱/质谱测定。

1.2.2 色谱条件

色谱柱：SILICA SG80 S5；2.0mm i.d.×150mm

流动相：A：0.1% 甲酸（5mol/L乙酸铵）B：CH3CN，0.1% HCOOH

B% 70%（0min）-＞70%（2min）-＞10%（6min）-＞10% （8min）-＞70%（12min）

流速：0.3mL/min

温度：35℃

进样量：5μL

1.2.3 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI+）。

喷雾压力：40psi。

干燥气流速：10L/min。

干燥气温度：350℃。

毛细管电压：4 000V。

表1 监测离子对及相关电压参数设定

2 结果与讨论

2.1 提取和净化条件的优化

动物肌肉组织和牛奶样品基质复杂，有很多内容源性的物质干扰分析测定，因此，必须对样品的提取和净化方法进行适当的优化，我们比较了不同浓度的三氯乙酸，发现20mL5%的三氯乙酸不仅可以充分的提取目标物，而且也能有效的沉淀样品中的蛋白，也防止高浓度的三氯乙酸污染质谱仪器。

Oasis HLB固相萃取柱是亲水亲酯平衡的反相萃取柱，是一种可适用于酸性，中性，碱性化合物的通用性萃取柱，实验证明Oasis HLB固相萃取柱对氨基糖苷类药物萃取效率较高，净化效果好。本方法对洗脱液的用量和类型进行了考察，选择甲醇作为洗脱液，得到了理想的效果，并优化了洗脱液的体积，采用6mL甲醇能够完全把目标物质洗脱下来。

2.2 色谱条件的优化

由于氨基糖苷类药物易溶于水，极性很强，在C18柱上保留很弱，目前国标方法中大多采用七氟丁酸等改性剂来增强该类物质的保留[4]，确实能获得分离度及对称因子较好的峰型，但是对于仪器的污染非常严重，会显著抑制负离子模式的响应，仪器的背景噪音会非常高。也有相关文献采用HILIC色谱柱等亲水性色谱柱来分离此类药物，但是笔者经过试验发现此类色谱柱重现性较差，平衡时间长，不利于大批量检测工作的开展。本实验采用SILICA SG80 S5色谱柱是普通硅胶柱，采用常用的甲酸乙酸胺-乙腈体系就能获得理想的分离度和灵敏度。通过考察不同浓度乙酸铵-乙腈体系，发现0.1%甲酸5moL/L乙酸铵-乙腈体系分离效果和响应最好，故以此作为流动相，并通过优化梯度，10种药物在15min内全部出峰，其总离子流图详见图1。

2.3 质谱条件的优化

质谱条件的优化用直接接二通方式进行，用0.3mL/min的流速将氨基糖苷类药物注入电喷雾离子源，进行一级质谱分析得到相应的分子离子峰，对分子离子峰进行二级质谱（子离子）扫描，获得二级质谱信息，然后对裂解电压及碰撞能进行优化，使分子离子和特征子离子强度达到最佳，然后进一步优化毛细管电压，雾化器压力，干燥器温度和流速等质谱参数使离子化效率达到最佳，具体参数见表1。

2.4 线性关系和检出限的考察

在本文所确定的色谱和质谱条件下，对氨基糖苷类药物进行测定，用空白基质配置一系列浓度分别为20，50，100， 200，500，1 000ng/mL，以目标物浓度为横坐标（X），对应的响应值为纵坐标（Y），进行线性回归，线性回归方程、线性关系，检出限和线性范围分别见表2。

图1 氨基糖苷类总离子流图

表2 标准溶液线性参数

2.6 方法回收率和精密度验证

对阴性样品分别进行3个浓度6次加标回收试验考察回收率和精密度，结果见表3。

表3 回收率试验（n=6）

由表3可知，样品平均回收率在76.5%～86.9%之间，相对标准偏差为2.3%～4.9%，本方法具有较高的精密度和准确度。

3 实验结论

本文建立了HPLC-MS/MS法测定动物肌肉组织和牛奶中10种氨基糖苷类药物的的检测方法。优化了前处理提取，净化，色谱和质谱条件，改变了氨基糖苷类抗生素在色谱柱上的保留行为，使氨基糖苷类抗生素与其它内源性的干扰物有良好的分离。该方法简单、灵敏度高、专属性强在浓度为20～1 000 ng/mL时具有良好的线性和精密度。

[1] 马彭.用链霉素微生物电极测定乳类食品中的链霉素[J].现代商检科技，1996，6（5）：30-31.

[2] 王忠斌.氨基糖苷类药物多残留酶联免疫分析方法的研究[J].中国食品学报，2008，8（5）：120-125.

[3] 周晓溪，姚羽.氨基糖苷类抗生素的分析方法进展[J].China pharmacist，2004，7（2）：142-144.

[4] 孙雷，张骊，黄耀凌.超高效液相色谱一串联质谱法检测动物源食品中8种氨基糖普类药物残留等.质谱学报[J]，2009，30（1）：60-64.

Simultaneous determination of muscle tissue and milk by LC-MS-MS Study on Optimization of 10 Kinds of Aminoglycoside Drugs

Ye Lei-hai，Zhong Shi-huan，Ye Jia-ming，Yang Lin，Xu Rong-nian

A method for the determination of spectinomycin，hygromycin B，streptomycin，dihydrostreptomycin，amikacin and kanamycin in animal muscle tissues and milk was established by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，10-aminoglycosides of anthracycline，tobramycin，neomycin and gentamicin.The samples were extracted by trichloroacetic acid and precipitated proteins were purified by HLB solid-phase extraction（SPE）column，separated by SILICA SG80 S5 and analyzed quantitatively in positive ion multiple reaction monitoring mode.The average recoveries were between 70% and 110% with the relative standard deviations（RSDs）of less than 15%，and the detection limits（LOD）were in the range of 0.02～1μg/mL，the correlation coefficient was more than 0.995 and 100，200，300μg/Kg.Mu]g/Kg.The method is simple，rapid and accurate，at the same time，it can avoid the contamination and ion suppression caused by the reagent of heptafluorobutyric acid.

high performance liquid chromatograpHy～tandem mass spectrometry；aminoglycoside；animal muscle tissue and milk

S859.84

A

1003-6490（2016）12-0107-03

2016-11-15

叶磊海（1983-），男，浙江杭州人，工程师，主要从事食品中兽药及兽药残留检测工作。