原核微生物基因敲除策略的研究进展

阳燕　杨英明,2　胡涛,2

1.口腔疾病研究国家重点实验室　华西口腔医院牙体牙髓病科（四川大学） 成都 610041；2.口腔疾病研究国家重点实验室　华西口腔医院预防科（四川大学） 成都 610041

原核微生物基因敲除策略的研究进展

阳燕1杨英明1,2胡涛1,2

1.口腔疾病研究国家重点实验室华西口腔医院牙体牙髓病科（四川大学） 成都 610041；2.口腔疾病研究国家重点实验室华西口腔医院预防科（四川大学） 成都 610041

基因敲除是一项20世纪80年代末发展起来的新型分子生物学技术，在微生物领域的机制和功能研究中，具有极其重要的意义。经过数十年的发展，基因敲除技术从最传统的同源重组策略发展出λRed重组系统、CreloxP重组系统等方法，近年又诞生了成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9等基于核酸内切酶原理的高效打靶技术，将微生物基因功能研究推向新的高度和方向。本文就这些应用于原核微生物的基因敲除策略的原理、现状和前景等研究进展作一综述。

基因敲除；聚合酶链反应；连接诱变技术；λRed重组系统；Cre-loxP重组系统；成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9技术

This study was supported by Special Prophase Project on National 973 Program（2012CB526707） and National Natural Science Foundation of China（81100746，81400507）.

［Abstract］Gene knockout is a new molecular technique that developed in 1980s which has plays crucial roles in the microbiology functional and basic research. Through the development of several decades，gene knockout technique has been evolved from traditional homogenous recombination to λRed recombination and Cre-loxP system. Recently，the clustered regulatory interspaced short palindromic repeat/Cas9 system has been thought to be a very promising methods for microbiology manipulation for its' convenience and effectiveness based on the activity of endonuclease. This review will focus on the gene deletion technique that has been applied in the microbiology research from the mechanism，application and prospect.

［Key words］gene knockout；polymerase chain reaction；ligation mutagenesis；λRed recombination；Cre-loxP recombination；clustered regularly interspaced short palindromic repeat/Cas9

基因敲除又称基因打靶，是一种通过一定途径使基因去除或失活的遗传工程技术，为定向改造细菌和真菌等微生物提供了重要的技术支撑，不仅克服了传统诱变方法的盲目性和偶然性，而且经改造的基因能进行稳定地复制遗传，是微生物遗传工程研究的重大飞跃。随着微生物基因组全序列的诠释和功能基因定位以及分子生物学技术的进步，以基因敲除对微生物进行基因功能的研究发展日益迅速。

基因敲除技术在基于基因重组技术的基础上，衍生出插入突变、RNA干扰、λRed重组系统、Cre-loxP重组系统等成熟且普遍使用的敲除策略，近年来兴起的锌指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）、转录激活因子样效应物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）、成簇的规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）/Cas9等多种具有极高特异性的基因靶向修饰技术，极大地提高了基因敲除的效率，为基因功能研究创造了新的途径。这些技术在胚胎干细胞和真核细胞领域的应用成为热点，但在原核微生物领域的应用、技术原理和最新进展却鲜有报道；因此，本文就原核微生物基因敲除策略的发展历程、原理、现状和前景等研究进展作一综述。

1　基于同源重组的基因敲除策略

同源重组是指在DNA分子内或分子间发生同源序列联会和片段交换的过程。利用DNA转化技术，将含有外源打靶基因和侧翼同源序列的重组载体转化入靶细胞，通过侧翼上同源序列的重组配对，使打靶基因整合并替换靶基因，再经复制传代，筛选出目的打靶菌株。

1.1环状自杀质粒技术

环状自杀质粒技术通过宿主细菌的自杀质粒载体来携带靶基因同源序列进行基因敲除，有单交换和双交换两种重组策略。同源单交换只发生一次同源重组，简便易行且较稳定［1］。单交换发生后，整个质粒载体插入靶基因内部并产生无活性靶基因。经过两次单交换才达到敲除靶基因的目的，称为同源双交换。同源双交换可通过缺失靶基因编码区中的某区段，或基因敲除后插入额外基因，如抗生素抗性基因、sacB负筛选标志基因等，达到目的基因失活的目的［2］。

1.2聚合酶链反应连接诱变技术

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）连接诱变技术是一种能在细菌中迅速构建基因敲除突变体的方法，完全不依赖中间媒介载体，减少了外源性载体在基因功能研究时可能造成的影响。该技术的基本路线为：首先设计引物P1/P2、P3/P4，分别扩增靶基因的侧翼序列，引物E1/E2扩增基因破坏盒子EmAM序列并引入酶切位点；对三组分片段进行酶切连接后，将连接片段转化导入宿主细菌细胞中，侧翼同源序列进行同源交换；最终EmAM序列替换敲除的目标序列。Lau等［3］采用PCR连接诱变技术在革兰阳性细菌中精确删除了目的基因，从而提供了该技术在微生物领域得以广泛应用的理论和实践依据。PCR连接诱变技术最大的优势是不需要额外导入载体，减少了外源性载体在基因功能研究时可能造成的影响。

基于同源重组原理进行的基因敲除技术能精确定点地改造DNA片段，不仅可以用突变基因敲除健康基因，以研究该基因的功能调控作用；也可用健康基因敲除突变基因，以达到性状改良或治疗遗传病的目的。由于原核微生物细胞的结构相对于真核细胞单一，因而同源重组敲除技术在微生物中有着更广泛的应用；然而，同源重组效率较低，尤其是大片段基因敲除使实际的工作量增加，载体或抗性基因的加入可能整合出新的未知功能，且载体或连接片段在某些菌种有一定的转化难度，这就极大地限制了该技术在微生物研究中的应用。

2　基于随机插入的基因敲除策略

插入缺失突变是利用可随机插入基因序列的病毒、细菌或其他基因载体，在靶基因中进行随机插入突变，再通过对相应的标志物进行筛选或已知的序列标签进行序列分析，从而获得相应基因敲除细胞的方法。目前应用于原核微生物较为有效的插入缺失方法，主要通过噬菌体或转座子插入突变。转座子是一种DNA序列单元，其两端为两个颠倒的重复序列，中间为抗性基因和转座酶转座子可在不同的复制子间转移，以一种非正常重组的方式随机插入到细菌DNA位点上，改变原有基因序列的排序，导致插入位置的基因突变或失活［4］。

基于随机插入的基因敲除策略，转座子或噬菌体可随机插入到革兰阳性菌或革兰阴性菌染色体的多个位点上，且插入后稳定性好，不易回复突变。基因插入过程是随机的，一般不能用于特定基因的敲除，通常需将该策略与直接突变的方法，如自杀质粒［5］进行互补。

3　基于噬菌体重组系统的敲除策略

3.1λRed重组技术

λRed重组系统为λ噬菌体重组系统，是利用整合到细菌染色体上或质粒中的Red系统编码的重组酶来实现外源性PCR片段与基因组中靶基因的同源重组。Red系统编码基因由exo、bet和gam组成，其中exo基因的产物为λ核酸外切酶，可将双链DNA 5'端切开，产生3'端DNA区段；bet基因编码的β蛋白可与单链DNA结合促进互补链复性，并可介导退火和交换反应。β蛋白和λ核酸外切酶形成的复合物具有调节核酸溶解和重组启动的作用。gam基因产物为一个多肽，结合到宿主的RecBCD蛋白形成二聚体，发挥外切酶活性［6］。

λRed重组系统的基因敲除策略［7］如下：先根据宿主染色体上需敲除的片段两端的序列设计合成一对引物，使每条引物的5'端有约50 bp的长度与靶序列同源，3'端与筛选基因同源。以含筛选基因的质粒为模板，PCR获得中间为筛选基因、两端为同源臂A和B的线性打靶DNA。将线性打靶DNA转化入含有Red重组系统的宿主菌，Red重组系统表达，λ核酸外切酶则结合到线性打靶DNA的同源臂A和B末端进行酶切，产生游离的3' DNA突出。此时，β蛋白则介导DNA链复性，从而使得同源臂和宿主DNA间以链入侵的方式重组。宿主DNA上A和B之间的序列被线性打靶DNA同源臂A 和B之间的筛选基因替换，从而完成对靶基因的定向敲除，得到靶基因缺失的突变株。

Red重组系统是一个独立的重组系统，在同源重组时不依赖细菌自身的重组系统，利用线性打靶DNA，不需体外构建重组质粒，缩短了试验周期，重组效率较传统方法明显提高［8］。Red重组系统主要应用于结肠杆菌并有大量报道［7，9］，但因其在其他微生物基因工程中存在同源臂长度过长或效率较低的缺点，仅在绿脓杆菌［10］和沙门菌［11］中被少量报道。在一定的试验条件下，如与Rac噬菌体系统重组为Red/ET重组系统［12］，或与Cre-loxP系统等其他技术结合使用，Red重组系统也可能更广泛地应用于结肠杆菌以外的微生物中。

3.2Cre-loxP重组系统

Cre-loxP重组系统是应用较普遍的一种条件性基因敲除方法，来源于结肠杆菌噬菌体P1，由Cre重组酶和loxP位点两部分组成。Cre重组酶可作用于多种结构的DNA底物，且位点专一［13］。loxP位点是一种长34 bp的回文序列结构，包括两侧13 bp的反向重复序列和中间8 bp的非对称间隔序列。Cre重组酶识别并结合loxP位点两侧的反向重复序列，并与中间的间隔区发生重组，不需任何辅助因子或蛋白质［14］。在Cre酶的介导下，当两个loxP位点同向位于同一个DNA分子上，loxP位点间的序列可被删除，留下一个loxP位点［13］。

Cre-loxP系统短小专一，特异性敲除基因不携带抗性标志物，避免了抗生素的应用，不影响基因的正常表达和调控，为后续研究提供了非常有效的手段。Cre-loxP重组系统目前已成功应用于多种真核细胞［15］，在原核微生物的基因敲除中也有报道，如肺炎链球菌［16］、变异链球菌［14］、乳酸链球菌［17］、伤寒杆菌［18］和炭疽杆菌［19］等，其在微生物基因敲除研究中有着良好的应用前景。

4　基于核酸内切酶的基因敲除策略——CRISPR/ Cas9技术

1987年研究者在结肠埃希菌K12的碱性磷酸酶基因附近发现了CRISPR，由一系列高度保守的正向重复序列和间隔序列排列而成［20］。这些间隔序列和一些噬菌体或质粒序列存在着同源性，为细菌和古细菌细胞提供了对抗外源基因的能力，从而起到适应性免疫的作用［21］。由于缺乏噬菌体和质粒的序列信息，所以在很长时间内，CRISPR的研究进展缓慢，其作为一种潜在技术并没有得到重视和发展。

伴随着对CRISPR功能的阐明和基因敲除技术的深入研究，Qi等［22］认为，CRISPR/Cas9可作为一种更为简便的基因编辑工具。《科学》于2013年初对CRISPR/Cas9技术进行了连载，CRISPR/Cas9技术随即成为一种成熟的基因组靶向修饰技术［23］，被广泛应用于各类体系的遗传学改造、转基因模式动物构建和基因治疗领域，成为了科学界最炙手可热的热点之一。

CRISPR/Cas9的作用机制大致分为3个阶。

1）CRISPR高度可变间隔区的获得。噬菌体或质粒间隔序列的5'或3'端延伸的几个保守碱基序列通常很保守，被称为PAM域（protospacer adjacent motifs）。当宿主细胞被噬菌体或质粒入侵时，宿主细胞先识别PAM，将其临近的protospacer序列整合入宿主基因组CRISPR5'端的两个重复序列之间，形成新的间隔序列［24］。

2）CRISPR基因座的表达。CRISPR基因座被转录成前体CRISPR RNA（pre-crRNA）后，在Cas蛋白或RNaseⅢ的作用下被剪切成一些由间隔序列和重复序列做成的小RNA，即成熟crRNA［25］。

3）CRISPR/Cas系统活性的发挥（或是对外源遗传物质的干扰）。当噬菌体或质粒入侵细胞时，成熟crRNA与Cas蛋白形成核糖核蛋白复合物，crRNA的间隔序列与外源DNA的靶序列完全或部分互补配对，外源DNA在配对的特定位置被核糖核蛋白复合物切割［26-27］。

CRISPR/Cas9这种类似于限制性核酸内切酶的作用特性，被迅速开发为各种生物基因位点的修饰。在真核生物中，人工合成的sgRNA能指导Cas9内源性核酸酶对斑马鱼胚胎基因的修饰［28］。有学者［23］利用一个包含2个不同靶向基因的间隔序列的crRNA实现了对2个基因同时进行编辑。至今，CRISPR/Cas技术已成功应用于人类细胞［29］、模式鼠［30］、植物［31］、斑马鱼［28］、蛙［32］、蠕虫［33］、果蝇［34］和酵母［35］等真核细胞的基因编辑。

CRISPR/Cas系统作为第三代基因编辑技术，操作简便，可用位置多。理论上基因组每8个碱基便有一个可用CRISPR/Cas9进行编辑的位置，对双链DNA和单链DNA均可灵活切开，且其基因编辑效率明显高于其他基因编辑技术［36］。在原核生物中，研究者［37］用设计好的DNA模板改造CRISPR/ Cas系统后，将其成功替换肺炎链球菌和结肠埃希菌相应基因实现了原核基因的定向修饰。CRISPR/ Cas9技术在原核微生物基因敲除中，有望成为一种新型高效的策略，有着解决其他技术难题和高效敲除的应用前景。

5　其他的基因敲除策略

5.1RNAi技术

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种RNA依赖的基因表达沉默现象，即将双链RNA （double stranded RNA，dsRNA）分子导入细胞，特异性降解细胞内与其同源的靶mRNA，阻止内源性目的基因表达，从而实现目的基因的敲除［38］。RNAi普遍存在于真核生物中，可抑制单个基因、整个基因组甚至基因家族的基因表达，具有操作简便快捷、穿透性强、特异性强和效率高等特点。

目前，该技术已在真菌、线虫、果蝇及拟南芥等真核生物中建立基因敲除模型［39］。随着对原核生物研究的进一步深入，原核细胞中同样存在着类似于小分子干扰RNA （small interfering RNA，siRNA）大小的msRNA［40-41］，其功能可能与siRNA相似，可能存在着类似于RNAi的干扰机制，从而应用于原核生物的基因敲除。

5.2ZFN技术和TALEN技术

ZFN和TALEN技术分别是第一代和第二代核酸内切酶基因编辑工具，其单体均有特异性识别DNA序列的蛋白质和一个非特异性核酸内切酶FokⅠ单体融合形成，具有在特异区域结合并形成二聚体发挥切断DNA双链的功能［42］。目前，ZFN最有效的构建策略可能是CompoZr方法。该方法效率高，特异性强［43］；而TALEN主要的组装方法有三种［44］：标准的限制性酶切、连接组装、Golden Gate组装和固相组装。ZFN和TALEN技术因其靶点在基因组上的序列高度特异性，而且无细胞类型限制，可以靶向编辑任意基因的特点，并使其在真菌［45］、植物细胞［46］、斑马鱼［47］、爪蟾［48］、果蝇［49］、动物细胞［47］及人类干细胞［8］等基因敲除中均有应用；但因细菌已经有上述高效的靶向技术，ZFN和TALEN技术在细菌基因敲除中的应用目前尚无报道。

6　小结

综上所述，原核微生物基因敲除技术是遗传工程研究的重大飞跃之一，为原核微生物的改造以及功能和疫苗研究提供了重要的技术支撑。随着分子生物学的理论发展和技术进步，新的基因敲除策略被不断发掘应用，使基因敲除成为简单易行的工具；然而，由于生物体的功能调节往往是多基因交互作用的结果，单个基因的敲除往往具有很大的局限性；因此，依赖原核生物的基因组测序结果，以功能表现为依据，利用最新的CRISPR/Cas9技术进行多基因的组合敲除研究，通过鸡尾酒式的方法来对原核生物基因进行敲除和过表达，实现目标表型的全局优化，可能是未来的一个很有潜力的发展方向［50］。

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（本文采编王晴）

Research progress on the knockout techniques of prokaryotic microorganisms

Yang Yan1，Yang Yingming1，2，Hu Tao1，2. （1. State Key Laboratory of Oral Diseases，Dept. of Conservative Dentistry and Endodontics，West China Hospital of Stomatology，Chengdu 610041，China；2. State Key Laboratory of Oral Diseases，Dept. of Preventive Dentistry，West China Hospital of Stomatology，Sichuan University，Chengdu 610041，China）

Q 756

A

10.7518/gjkq.2016.05.019

2015-09-19；［修回日期］2016-03-26

973计划前期研究专项计划（2012CB526707）；国家自然科学基金（81100746，81400507）

阳燕，博士，Email：yy.0225@163.com

杨英明，讲师，博士，Email：lyra-hscn@163.com