肝星状细胞在肝脏发育和再生中作用的研究进展*

姚荔嘉　邓　星　王　维　谢渭芬

第二军医大学附属长征医院消化内科(200003)



·综述·

肝星状细胞在肝脏发育和再生中作用的研究进展*

姚荔嘉#邓星王维谢渭芬&

第二军医大学附属长征医院消化内科(200003)

摘要肝星状细胞(HSCs)是位于肝窦内皮细胞与肝上皮细胞之间的一种多能细胞。HSCs激活后转化为肌成纤维样细胞，增殖并上调部分促炎和促纤维化基因表达，从而促进肝纤维化。既往对HSCs的研究主要集中在其与肝纤维化的关系方面，近年研究发现在肝脏发育和再生过程中，HSCs对肝脏细胞的增殖、分化和成熟亦至关重要。本文系统总结了HSCs的来源、发育调控和功能，着重阐述近年关于HSCs在肝脏发育和再生中作用的研究进展，以期为肝脏疾病的治疗提供新思路。

关键词肝星状细胞；肝脏；生长和发育；再生

Research Progress on Role of Hepatic Stellate Cells in Liver Development and Regeneration

YAOLijia,DENGXing,WANGWei,XIEWeifen.

DepartmentofGastroenterology,theSecondMilitaryMedicalUniversityAffiliatedChangzhengHospital,Shanghai(200003) Correspondence to: XIE Weifen, Email: weifenxie@medmail.com.cn

AbstractHepatic stellate cells (HSCs), the pluripotent cells, exist between liver sinusoidal endothelial cells and hepatic epithelial cells. Activated HSCs transform to myofibroblast-like cells, start to proliferate, anddenovoexpress some proinflammatory and profibrogenic genes, which promote hepatic fibrogenesis. Previous studies mainly focused on the relationship between HSCs and liver fibrosis, however, recent studies indicate that HSCs are essential for proliferation, differentiation and maturation of various liver cells in the process of liver development and regeneration. This review systematically summarized the source, developmental regulation and function of HSCs, and focused on progress of recent studies on the role of HSCs in liver development and regeneration. The novel knowledge of HSCs may provide clues for treatment of liver diseases.

Key wordsHepatic Stellate Cells;Liver;Growth and Development;Regeneration

肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)为肝脏特异性间充质细胞，位于肝窦内皮细胞与肝上皮细胞之间的窦周间隙，约占肝脏细胞总数的5%～8%。在健康肝脏中，HSCs处于静止状态，主要功能为储存维生素A、调节肝血流和肝内免疫反应等。在慢性肝脏疾病中，受损的肝细胞和免疫细胞通过分泌信号分子激活HSCs并使之转化为肌成纤维样细胞，增殖并上调部分促炎和促纤维化基因表达，HSCs持续和反复激活将导致肝纤维化，产生永久性瘢痕，破坏肝脏正常结构和功能。近期诸多研究发现，除参与肝纤维化外，HSCs在肝脏发育和再生中亦发挥重要作用。本文就近年相关研究进展作一综述，以期为肝脏疾病的治疗提供新思路。

一、HSCs概述

1. HSCs的来源：HSCs于19世纪由Kupffer首次发现。尽管近数十年来人们对这一细胞进行了大量研究，但仍未能完全明确其在肝脏中的来源和功能。有学者发现HSCs表达多种神经元或神经胶质细胞标记物，如神经细胞黏附分子(neural cell adhesion molecule, NCAM)、突触素(synaptophysin)、胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)、巢蛋白(nestin)、p75神经营养因子受体(p75 neurotrophin receptor, p75NTR)，因此认为HSCs可能起源于外胚层神经嵴[1]。但Cassiman等[2]应用细胞谱系示踪技术并未在发育的肝脏中检测到神经嵴来源的HSCs。另有学者发现胎肝中存在造血干细胞标记物CD34+和细胞角蛋白(cytokeratin, CK)7/8+的星状细胞，提示HSCs可能来源于内胚层[3]。还有研究[4]发现HSCs表达间质干细胞标记物，且有向脂肪细胞或骨细胞分化的潜能，表明HSCs起源于间质干细胞。HSCs，尤其是活化的HSCs能表达中胚层标记物如结蛋白(desmin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)，提示其来源于中胚层，Asahina等[5]的研究结果支持此观点。此外，部分学者提出HSCs是由横膈间皮细胞迁移发育而来，Asahina等[6]发现小鼠中胚层原始横膈间皮细胞由肝脏表面向肝内迁移，并逐渐分化为HSCs。综上，HSCs可同时表达内、中、外胚层标记物，但其来源迄今仍未完全阐明。

2. HSCs的发育调控：目前关于HSCs发育调控的研究报道相对较少，已有研究表明血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)信号通路在HSCs分化、迁移进入肝脏的过程中发挥重要作用。Yin等[7]的研究发现，在HSCs的发育过程中，抑制VEGF信号能显著减少迁移进入肝脏的HSCs数量，并严重影响HSCs存活；然而，在HSCs发育的终末阶段，抑制VEGF信号仅能导致HSCs轻度减少。此外，一些发育相关基因如Wt1(Wilms tumor 1 homolog)、Lhx2(LIM homeobox protein 2)在维持HSCs的正常发育中亦起有重要作用。在胚胎发育过程中敲除Wt1基因可导致HSCs祖细胞异常分化，进而影响HSCs的正常发育，导致肝脏体积缩小和形态异常[8]；在胚胎中敲除Lhx2基因可引起大量HSCs异常活化，导致与肝纤维化相关的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)进行性沉积，影响肝脏发育[9]。然而，Wt1和Lhx2抑制HSCs异常活化的下游信号通路仍未阐明，有待进一步研究。

二、HSCs在肝脏发育中的作用

HSCs在肝脏发育过程中极为靠近肝上皮细胞、内皮细胞和造血细胞，表明其可能参与调节这些细胞的增殖、分化和成熟。胚胎HSCs能表达生长因子和丝裂原，这些物质在肝脏发育过程中对肝上皮细胞的增殖至关重要。在Wt1敲除的胎肝中，HSCs异常活化，细胞内催化维甲酸合成的视黄醛脱氢酶2(RALDH2)表达下调或缺失，影响肝脏祖细胞的增殖、扩散[8]。另一方面，HSCs在肝脏祖细胞的分化中亦可能扮演重要角色。Suzuki等[10]的研究发现，ECM可影响肝脏祖细胞分化，在决定肝脏祖细胞向肝细胞或胆管细胞方向分化的过程中，不同ECM组分具有不同效应。而HSCs可分泌多种ECM，提示其在肝脏祖细胞分化中起重要作用。Notch信号通路在肝内胆管细胞的分化和胆管形态发生中扮演关键角色[11]。有研究发现门静脉间质中的Notch配体Jagged1失活可导致肝内胆管缺失[12]，鉴于胎肝门管区HSCs亦表达Jagged1[13]，推测HSCs的出现和分布可能与肝内胆管发育有关。进一步探索HSCs是否通过Notch信号通路调节胆管发育具有重要意义。

在血管生成过程中，窦周细胞和窦内皮细胞之间的相互作用对血管成熟及其完整性至关重要。在肝脏中，HSCs相当于窦周细胞，通过分泌血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)与窦内皮细胞产生联系，影响肝脏血管结构和功能[14]。在β-catenin敲除小鼠肝脏中，HSCs异常活化并聚集在扩张的肝窦周围，这一发现支持上述观点[15]。在哺乳动物胚胎发育过程中，肝脏为主要造血器官。胚胎HSCs表达的基质细胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor-1α, SDF-1α)是一种强效造血干细胞化学诱导剂[16]，可募集表达SDF-1α受体CXCR4的造血干细胞进入胎肝。这些发现均提示HSCs与肝脏血管发生有密切联系。

三、HSCs在肝脏再生中的作用

肝脏再生为一多步骤过程，包括起始和终止，当再生后的肝脏代谢满足机体需求时，肝脏即停止再生。转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)是最重要的促纤维化和抗增殖因子，是肝脏再生反应的关键介质，而HSCs是合成TGF-β的主要细胞[17]。在大鼠肝脏再生模型的再生早期收集HSCs条件培养基进行检测，可发现其中含有大量与肝细胞增殖相关的细胞因子和趋化因子，再生起始阶段，肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)等因子强大的促有丝分裂能力可能超过TGF-β1的抗增殖作用，至再生终末期，HSCs分泌高水平的TGF-β1，抑制肝实质细胞增殖，甚至诱导细胞凋亡[18]。在原代培养的小鼠HSCs中，5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)可通过与HSCs上的5-HT2B受体结合增强TGF-β1表达，而5-HT2B受体拮抗剂则可促进肝部分切除术(partial hepatectomy, PH)、胆管结扎和CCl4诱导的急慢性肝损伤模型的肝细胞生长，抑制肝纤维化[19]。因此，HSCs可能通过改变细胞因子表达谱调节肝脏再生。

HSCs的活化对肝脏再生至关重要。2-乙酰氨基芴(2-acetylaminofluorene, 2AAF)是一种肝细胞增殖抑制剂，应用2AAF/PH可建立基于肝脏祖细胞或卵圆细胞的肝脏再生修复模型[20]。为证实活化的HSCs对肝脏再生的重要性，有研究以对乙酰氨基酚或2AAF/PH诱导肝损伤动物模型，再以胶霉毒素[21]或左旋半胱氨酸[22]清除或抑制活化的HSCs，发现肝细胞和卵圆细胞的正常再生反应受到抑制，肝损伤加重。Kalinichenko等[23]构建了Foxf1+/-小鼠模型，并以CCl4诱导肝损伤，结果显示与对照组相比，Foxf1+/-小鼠肝脏修复和HSCs活化受限，肝损伤持续加重。上述研究结果证实HSCs活化是促进受损肝组织修复的重要环节。

活化的HSCs产生大量细胞因子和趋化因子[24]，这些因子可直接增强肝脏祖细胞和肝细胞的增殖能力，或间接作用于肝窦内皮细胞和免疫细胞，促进肝脏再生。Deng等[25]的研究表明，完全活化的HSCs可通过分泌HGF诱导骨髓间质干细胞向类肝细胞分化。对2AAF/PH大鼠肝损伤模型的研究[18]发现，肝脏再生早期HSCs条件培养基中含有高水平的HGF，可促进卵圆细胞增殖。在人类慢性肝纤维化进程中，活化的HSCs表达p75NTR。研究[26]发现，p75NTR缺失小鼠的HSCs在体外培养时无法正常分化为肌成纤维细胞，导致HGF合成受损，进而影响肝细胞增殖，使肝脏病变加重。由于p75NTR信号系通过Rho调节HSCs分化，因此持续激活Rho蛋白可恢复p75NTR-/- HSCs的分化能力。Hedgehog(Hh)信号通路可能是肝脏再生过程中HSCs与肝细胞间相互作用的另一条途径。活化的HSCs可表达Hh信号通路组分之一——一种名为音猬因子(sonic hedgehog, Shh)的蛋白质以及Hh抑制剂Hip，在活化HSCs的培养过程中，Hip表达减少，Shh表达增加，后者作为活化HSCs的自分泌生长因子激活Hh信号通路并参与肝脏病理进程[27]。在PH诱导的小鼠肝脏再生模型中，肝细胞中Hh配体产生增加，Hh信号通路活化，可诱导肝细胞增殖[28]。

除上述路径外，HSCs还可能作为肝上皮细胞祖细胞，在肝脏再生过程中通过间质-上皮转换(mesenchymal-epithelial transition)生成肝细胞。Kordes等[29]将活化的胰腺星状细胞(pancreatic stellate cells, PSCs)移植入2AAF/PH诱导的大鼠肝脏再生模型中，发现PSCs可分化为肝细胞和胆管细胞，参与肝脏修复。后续研究[30]以2AAF/PH或倒千里光碱(retrorsine)/PH建立大鼠肝脏再生模型并予移植HSCs，结果显示移植的HSCs可形成间充质组织、祖细胞、肝细胞和胆管细胞，从而促进肝脏再生。此外，与正常大鼠相比，该研究使用的纯合GUNN大鼠肝细胞由于缺乏Ugt1a1基因，胆红素处理功能受损，而移植HSCs可改善模型大鼠的肝脏胆红素处理功能缺陷，升高血清直接胆红素水平；体外培养的HSCs在分化为肝细胞和胆管细胞的过程中能一过性获得肝脏祖细胞基因表达谱，亦提示HSCs可能为肝脏祖细胞的来源之一。Michelotti等[31]通过细胞谱系示踪技术发现，HSCs为肌成纤维细胞和肝脏祖细胞的来源之一，具有分化成为肝细胞和胆管细胞的能力。上述研究均表明HSCs为肝脏前体细胞的来源之一，且有助于肝脏再生。

四、HSCs研究存在的问题

要充分了解HSCs在肝脏再生中所扮演的角色，在不同肝损伤再生模型中清除HSCs被认为是最理想的途径。既往研究主要是通过一些化学药物，如胶霉毒素、左旋半胱氨酸选择性抑制动物模型中的HSCs，但这些药物对其他类型肝细胞的影响尚难以排除。小鼠GFAP启动子可驱动单纯疱疹病毒胸苷激酶(thymidine kinase, Tk)基因在HSCs中特异性表达。在GFAP-Tk转基因小鼠中，应用更昔洛韦可诱导HSCs凋亡[32]，但该模型并不能完全清除HSCs，故其应用存在局限性。

肝脏再生经由哪条信号通路介导取决于初始损伤的性质及其严重程度，完善的多样性动物模型的建立将极大促进未来HSCs在肝脏再生中作用的研究。啮齿类动物模型的优势在于可体外分离、培养和激活HSCs，而斑马鱼(zebra-fish)活体成像技术适用于研究肝脏再生过程中细胞间的相互作用。与啮齿类动物模型一样，PH和化学物质亦可诱导斑马鱼体内的肝脏再生。此外，基因工具的研发将有助于其他肝脏再生模型的进展。然而，由于人体内不同病因所诱发的肝损伤再生及其病程的复杂性，迄今为止，动物模型仍无法完全模拟人类肝脏再生。

五、结语与展望

HSCs被称为肝内多能细胞，参与肝功能活动以及肝脏疾病的发生、发展。既往对HSCs的研究主要集中在其与肝纤维化的关系方面，但多年来以HSCs为靶点治疗肝纤维化并未能取得突破性进展。近年研究发现HSCs在肝脏发育和再生中发挥重要作用，并初步阐明了HSCs参与肝脏发育和再生的作用机制。一系列研究结果表明HSCs的作用远较想象中复杂，以HSCs为靶点治疗肝纤维化，在抑制ECM产生和沉积的同时，可能会影响肝脏再生，提示肝纤维化的治疗需要寻求新的思路和方法。此外，考虑到HSCs在肝脏发育和再生中所起的重要作用，对其作进一步探索将极大推进肝功能衰竭甚至肝细胞癌等疾病的治疗研究。

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(2016-02-04收稿；2016-02-15修回)

*基金项目：国家自然科学基金(81470871)

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2016.03.009

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&本文通信作者，Email: weifenxie@medmail.com.cn