当归多糖的提取、分离及纯化

张清勇　于宏　王庆奎　孙学亮　邢克智　郭永军

摘 要：对当归多糖的提取方法进行了优化，并测定了当归多糖得率及当归多糖中蛋白质、总糖和还原糖的含量。结果表明先用乙醇进行处理可以改变当归多糖的的获得率，乙醇渗漏方法的当归粗多糖获得率最高。

关键词：当归多糖；总糖；还原糖

当归为伞形科（Umbrelliferae）植物当归（Angelica sinensis（Oliv）Diels）的根，药性甘、辛、温，有活血、补血、润肠滑肠、调经止痛的功效，对于临床应用使用的频率很高，素有“十方九归”的美称[1]。随着现代分离技术和仪器的进步，当归的多种成分被分离出来，当归多糖是从植物当归原料中提取的水溶性多糖，是当归的主要活性成分之一[2-3]。

目前当归多糖的提取、分离及纯化方法主要是传统的水提醇沉后脱蛋白[4]。但影响水提醇沉的因素有很多，比如水提时间、温度、料液比以及水提次数等[5]。传统方法先将中草药当归加水煮沸，离心，上清液浓缩后加入一定体积的乙醇，静置过夜，得到当归多糖粗制品。粗制品加一定量的去离子水溶解，用不同的方法去除蛋白质后，透析、冷冻干燥后得到初步纯化的当归多糖[6-7]。但得到的当归多糖得率并不高，并且费时费力。本试验拟比较3种植物多糖的提取方法，寻找当归多糖的最佳提取方法，为当归多糖的后续研究提供前期基础。

1 材料与方法

1.1 材料

中草药当归购于本地中草药市场，产地甘肃。

1.2 试剂与仪器

5%苯酚溶液：精确称取2.449 6 g苯酚置于50 mL烧杯中，加入蒸馏水，玻璃棒搅拌使其充分溶解，然后置于50 mL容量瓶中定容。定容后装入棕色玻璃瓶，以防苯酚溶液被氧化。

透析袋MW：8 000～14 400，BioSharp，USA。透析袋前处理：透析袋剪成适当的长度，将透析袋在含1 mmol/L EDTA 和2% 碳酸氢钠（NaHCO3）的溶液中煮沸10 min，用蒸馏水清洗干净，置于20%乙醇溶液中4 ℃冷藏备用。

1.3 试验内容

1.3.1 当归粗多糖的分离提取

提取方法Ⅰ：将自然风干后的新鲜当归，直接用蒸馏水煮沸30 min，料液比为1∶30，最后得到的提取液用无水乙醇进行醇沉，乙醇终浓度至80%，搅拌均匀后，4 ℃冷藏静置6 h后离心（4 000 r/min，10 min）。沉淀用95%乙醇去除色素，直到上清无色为止，沉淀冷冻干燥后即为当归粗多糖（Crude angelica sinensis polysaccharide，CASP）。

提取方法Ⅱ：将新鲜当归自然风干并处理成小片，用体积分数为75%的乙醇溶液浸泡一周，料液比为1∶10，浸泡并不时搅动。醇提后残渣先用水煮沸30 min，料液比为1∶30，上清液中加入无水乙醇使乙醇终浓度至80%，搅拌均匀后4 ℃冷藏静置6 h后离心（4 000 r/min，10 min）。将沉淀反复用95%的乙醇脱色，直到上清液无色，沉淀冷冻干燥后即为CASP。

提取方法Ⅲ：将自然风干后的新鲜当归处理成小块状，用78%的乙醇浸泡一周，料液比为1∶10，要经常搅拌，浸泡好后用76%的乙醇进行渗漉，直到渗出液无色为止，将渗漉后的当归用蒸馏水煮沸30 min，料液比为1∶30，水煮后得到的提取液加入无水乙醇使乙醇终浓度至80%，搅拌，4 ℃冷藏静置后离心（4 000 r/min，10 min）。将沉淀反复用95%的乙醇脱色，直到上清液无色，沉淀冷冻干燥后即为CASP。

1.3.2 CASP的脱蛋白处理 当归粗多糖加三蒸水溶解（浓度为2 mg/mL），采用Sevag法脱蛋白[8]：当归多糖粗提物溶液中按体积比为3∶1加入Sevag试剂，放在磁力搅拌器上搅拌45 min后离心（4 000 r/min，10 min）。离心后溶液分为三层，上层为多糖溶液，中层为蛋白质凝胶层，底层为有机溶剂。取上层多糖溶液重复上述步骤，直到蛋白质凝胶层消失。多糖溶液在280 nm波长附近无特征吸收峰，说明多糖中的蛋白质已经去除。

1.3.3 透析 将脱蛋白后的多糖溶液移到处理好的透析袋中，放入三蒸水中透析3～4 d。透析过程中，要注意勤换水。透析好的多糖溶液经旋转蒸发仪浓缩后冷冻干燥得到当归多糖（Angelica sinensis polysaccharide，ASP）。

1.3.4 CASP和ASP蛋白质、总糖和还原糖含量测定 采用考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量。精密称取100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，最后用蒸馏水定容至1 000 mL。放于棕色瓶中备用。精确称取牛血清白蛋白10 mg，用蒸馏水溶解并定容至100 mL，配成0.l mg/mL的标准蛋白质溶液。精密吸取蛋白质标准溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、和l mL，分别置于10 mL比色管中，然后加入配制好的考马斯亮蓝G-250溶液5.0 mL溶液，各管用蒸馏水加至6.0 mL，摇匀后放置2 min，用紫外分光光度计在波长595 nm处测定吸光度，将上述数据进行线性回归，得标准曲线方程：y=0.006 x+0.014，相关系数为0.999，线性良好。精密称取10 mg多糖样品，用蒸馏水溶解并定容至10 mL，精密吸取1.0 mL多糖样品溶液，加入考马斯亮蓝溶液5.0 mL，振荡摇匀，静置2 min后，在595 nm处测定其吸光度，从标准曲线上查得蛋白的浓度。

采用苯酚-硫酸法测定总糖含量。用分析天平精密称取葡萄糖（105 ℃下干燥至恒重）100 mg，置于烧杯中用蒸馏水溶解后，置于1 000 mL容量瓶中定容，摇匀，配得葡萄糖标准溶液。精密吸取葡萄糖标准溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和l mL，分别置于10 mL比色管中，然后加入5%的重蒸酚1.0 mL溶液，摇匀，加入浓硫酸5.0 mL，加蒸馏水至刻度，摇匀后放置5 min，再于沸水浴中加热15 min，取出冷却至室温。另以蒸馏水20 mL加5%的重蒸酚和硫酸，同上做空白对照，用紫外分光光度计在波长490 nm处测定吸光度，将上述数据进行线性回归，得标准曲线方程：y=0.007 x+0.089，相关系数为0.999，浓度范围在0～0.l mg/mL，线性良好。精密称取多糖样品20 mg，用蒸馏水溶解并定容至1 000 mL，精密吸取多糖样品溶液0.2 mL，按上述方法测定吸光度，从标准曲线中求出样品中总糖的含量。

用蒽酮-硫酸法测定还原糖活力。用分析天平精密称取葡萄糖（105 ℃下干燥至恒重）100 mg，置于烧杯中用蒸馏水溶解后，置于1 000 mL容量瓶中定容，摇匀，配得葡萄糖标准溶液。精密吸取葡萄糖标准溶液0.0、0.2、0.4、0.8、1.2、和l.6 mL，分别置于10 mL比色管中，然后加入005%的蒽酮-硫酸溶液4.0 mL，混匀，立即用冰水冷却，再于沸水浴中加热5 min，取出在冰水中冷却30 min。将上述数据进行线性回归，得标准曲线方程：y=0.054 x+0.288，相关系数为0999，线性良好。精密称取多糖样品20 mg，用蒸馏水溶解并定容至1 000 mL，精密吸取多糖样品溶液0.2 mL，按上述方法测定吸光度，从标准曲线中求出样品中还原糖的含量。

1.4 数据处理

所得数据（平均值±标准误表示，n=3）用Excel 2003和SPSS 18.0处理，做单因素方差分析，显著水平为p<0.05。

2 结果

2.1 CASP得率

CASP得率的结果见表1。结果表明：第III种提取方法的CASP得率显著高于其它提取方法。

2.2 蛋白质、总糖和还原糖含量

将分离到的CASP和ASP配成一定浓度的溶液，测定其蛋白质、总糖和还原糖含量，由标准曲线计算结果见表2。

3 讨论

目前当归多糖的提取方法主要是传统的水提醇沉工艺、超声波萃取和微波萃取法等[4]。本试验采用水提醇沉的方法提取当归粗多糖，影响水提醇沉的方法效果有很多因素，比如水提时间、温度、料液比以及水提次数等[5]。杨婧等[9]通过正交试验得出了水提法得到当归多糖的最佳条件：水提时间为30 min、温度为100 ℃、料液比为1∶20、提取2次。但是水提醇沉的方法本身也有很多缺点，反复高温可能破坏多糖结构，乙醇的浓度也会影响当归多糖的提取率。因为当归中含有大量脂溶性物质，所以本试验先用乙醇去除一部分脂溶性物质[10]。本试验采用Sevag法脱蛋白，王庆奎等[7]通过试验得出了sevag法脱除当归多糖蛋白的最佳条件。本试验结果表明，先用乙醇进行处理可以改变当归粗多糖的获得率，乙醇渗漉方法的当归粗多糖的获得率最高。

参考文献：

[1]刘俊栋，刘海霞，李建基，等.当归多糖对免疫系统作用的研究[J].四川畜牧兽医，2005（3）：34-35

[2] 徐国钧，何宏贤，徐珞珊，等.中国药材学[M].北京：中国医药科技出版社，1996：332-338

[3] 邓永健，郭志伟，王萌.当归的化学成份及其药理作用研究进展[J].新疆中药，2006，24（5）：109-113

[4] 刘雪平.当归有效成分分离纯化工艺的研究进展[J].内蒙古中医药，2011（13）：93-95

[5] 韦玮，龚苏晓，张铁军.当归多糖的提取纯化工艺研究[J].中草药，2009（S1）：137-139

[6] 孙元琳，杨萍芳，吴海霞，等.水法提取当归多糖工艺条件优化[J].中国食品学报，2009（05）： 130-134

[7] 刘 娟，彭仁王秀，乐江，等.当归多糖的分离纯化及其部分理化性质的研究[J].华西药学杂志，2004，19（6）：412-414

[8] 王庆奎，邢克智，赵海运，等.当归多糖除蛋白质的方法与条件优化[J].时珍国医国药，2011（2）：10-12

[9] 杨婧，李琴，林河春，等.当归多糖水提法正交设计及最佳Savags法去蛋白工艺[J].安徽农业科学，2009（24）：11532-11533+11536

[10] 赵迪加，张水寒，王宇红，等.妇炎宁中当归渗漉法提取工艺的研究及其与双提法样品的镇痛作用比较[J].中成药，2007（9）：1360-1362

Abstract：The sinensis polysaccharide yield was optimize and measured angelica sinensis polysaccharide content of protein， total sugar and reducing sugar .Results showed that the use of ethanol first processing can change the gain rate of angelica sinensis polysaccharide， ethanol sinelica angelica polysaccharide to obtain the highest rate of leakage method.

Key words：Angelica sinensis polysaccharide；；total sugar；reducing sugar

（收稿日期：2015-12-11）