生物转化制备红参Rh1皂苷组及成分分析

王 肖 冰，　刘 春 莹，　王 　 上，　鱼 红 闪，　金 凤 燮

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连　116034 )



生物转化制备红参Rh1皂苷组及成分分析

王 肖 冰，刘 春 莹，王 上，鱼 红 闪，金 凤 燮

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连116034 )

摘要:利用TLC和超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)分析已制备的Rh1组异构体，利用HPLC分析其异构体的质量比。Rh1组在TLC图谱中显2个斑点，经UPLC-MS的分析，确认红参皂苷Rh1组含有4种异构体，分别是20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3和Rh4；高效液相色谱检测结果表明红参皂苷Rh1组中4种异构体20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3、Rh4的质量比为25.0∶18.8∶15.5∶40.7，4种异构体总质量分数在90%以上。

关键词:红参皂苷Rh1组；异构体；高效液相色谱；高效液相色谱-质谱联用

0引言

人参为五加科多年生植物的干燥块根和茎，其根茎均可入药[1]。人参皂苷Rh1组由20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3、Rh4等4种异构体所组成，且Rh1组皂苷由于4种异构体的协同作用，活性远高于Rh1单体[2]。Rh1具有抗肿瘤、抑制癌细胞的作用[3-4]，可诱导癌细胞的分化逆转[5]，有抑制体外培养人胃癌细胞生长速度和分裂能力的作用[6]。人参皂苷Rh1组还有很强的保护肝细胞、保护脑神经细胞、防止老年痴呆、增强机体对病毒的抵抗力等疗效[7-9]。

生晒人参中，80%以上的人参皂苷为20(S)的Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Re、Rg1[10]，这些皂苷活性低、吸收率低，总皂苷平均吸收率只有5%[11-12]。但是红参稀有皂苷Rg3、Rh2、Rg2、Rh1，Rg5和Rk1，Rh3和Rk2，Rg4(F4)和Rg6，Rh4和Rk3吸收率高，具有很好的生理功能[13-14]。

红参加工过程中，在人参自身的酶、其他物质的作用下，主要人参皂苷为20(S)的Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Re、Rg1的20(S)-O-R2的糖基水解，生成20(S)-OH和20(R)-OH的Rg3、Rh2、Rg2、Rh1、Rs3皂苷的两种异构体[15]；20(S)-OH和20(R)-OH 的皂苷进一步脱水形成反式、顺式异构体Rg5和Rk1、Rh3和Rk2、Rg4(F4)和Rg6、Rh4和Rk3、Rs4和Rs5[16]；但是Rs皂苷失掉有机酸基，稳定的红参皂苷共16种，可分为4种异构体的Rg3组、Rg2组、Rh2组、Rh1组[17]；这些红参皂苷群在传统红参中的含量很低，而且Rg3组、Rg2组、Rh2组、Rh1组的16种皂苷交织在一起，无法从红参中分离提取红参皂苷[18]。

为此，本实验室田桐等[19]研究了Rg3组的制备和分离；刘飞等[20]研究了生物转化制备Rg2组；何丹[21]研究了F2制备并由F2制备Rh2组。本实验主要研究了生物转化制备的Rh1组成分。

1试验

1.1材料与仪器

人参皂苷20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3和Rh4混合物标准品，由本实验室提供；红参皂苷Rh1组，本实验室制备。

薄层层析板Silica gel 60-F254，德国Merck公司；高效液相色谱仪，美国Waters公司；超高效液相色谱质谱联用仪，美国Waters公司。

1.2试验方法

1.2.1薄层层析法(TLC)

用刻度毛细管吸取标准品及样品，点样于薄层层析板上。展开剂配比按氯仿-甲醇-水体积比7∶2.5∶0.5，10%硫酸加热显色。

1.2.2超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)

色谱柱，BEH shield RP18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)。流动相为0.1%甲酸-乙腈(A)与0.1% 甲酸-水(B)混合物。梯度洗脱：0～5 min，5%～95% A线性梯度；5～10 min，95% A等度。进样量，10 μL；体积流量，0.5 mL/min；柱温，30 ℃；检测波长，203 nm。

毛细管电压，2.5 kV；样品孔电压，35 V；离子源温度，100 ℃，脱溶剂气温度，350 ℃；锥孔气体积流量，50 L/h，脱溶剂气体积流量，1 000 L/h；质量扫描范围，100～1 000 Da。

1.2.3高效液相色谱法

Waters 2996二极管阵列检测器及Empower色谱工作站；Knauer C18色谱柱(5 μm，250 mm×3 mm)；样品进样量，10 μL；柱温，35 ℃；体积流量，0.6 mL/min；检测波长，203 nm；乙腈(A)-水(B)梯度洗脱：0～20 min，20% A等度；20～31 min，20%～32% A线性梯度；31～40 min，32%～43% A线性梯度；40～70 min，43%～100% A线性梯度。

2结果与讨论

2.1Rh1组的薄层层析(TLC)检测结果

利用薄层层析法(TLC)初步分析红参皂苷Rh1组异构体组成，结果如图1所示。从图1中可以看到，Rh1组有2个斑点，上斑点可能为Rk3和Rh4重叠，显示为一个斑点；下斑点可能为20(S)-Rh1和20(R)-Rh1重叠，显示为一个斑点。TLC检测结果初步证明，Rh1组产品中可能含有4种异构体20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3和Rh4。

1，Rg1；2，Rh1标准品；3，Rk3、Rh4混合物标准品；

2.2超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)分析Rh1组分

采用超高效液相色谱法对Rh1组人参稀有皂苷进行检测，结果如图2所示。从图2中可以看出，Rh1组有4个明显的紫外吸收峰，其保留时间依次为2.92，2.98，3.64，3.71 min，与人参稀有皂苷20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3和Rh4标准品的UPLC谱图一致，说明Rh1组产品中含有这4种人参皂苷成分。

采用串联质谱法对Rh1组的4种人参皂苷的相对分子质量进行测定。在负离子模式下，串联质谱(Q/TOF)检测得到Rh1组样品的总离子流图，如图3所示。从图3中可以看出，Rh1组中4种人参皂苷在总离子流图中的保留时间依次为2.95，3.02，3.68，3.74 min，与UPLC图中各组分的保留时间相符。

再通过对总离子流峰进行一级质谱分析，确定Rh1组样品中各物质的相对分子质量。首先对ESI-模式下的Rh1组中保留时间为2.95和3.02 min 的人参稀有皂苷的离子峰进行一级质谱分析，如图4所示。

图3　ESI-模式下Rh1组样品总离子流图谱

(a) 20(S)-Rh1

(b) 20(R)-Rh1

图420(S)-Rh1和20(R)-Rh1在ESI-模式下的一级质谱图

Fig.4Thechromatogramoflevel1of20(S)-Rh1and20(R)-Rh1inESI-mode

从图4可以看出，这2种人参稀有皂苷在ESI-模式下通过Q/TOF均得到离子峰m/z=683。该离子峰为[Rh1+HCOOH]-离子峰，而负离子模式下又减少一个H；因此，这2种物质的相对分子质量均为638，与人参稀有皂苷20(S)-Rh1和20(R)-Rh1的相对分子质量相同。由此证明，Rh1组中含有人参稀有皂苷20(S)-Rh1和20(R)-Rh1。

再对ESI-模式下的Rh1组人参稀有皂苷中保留时间为3.68和3.74min的离子峰进行一级质谱分析，如图5所示。

皂苷名称保留时间/min面积面积比/%20(S)-Rh138.966407446725.0120(R)-Rh139.517306293318.80Rk346.194253012815.53Rh446.932662317340.66

(a) Rk3

(b) Rh4

图5Rk3、Rh4在ESI-模式下的一级质谱图

Fig.5Chromatogram of level 1 of Rk3 and Rh4 in

ESI-mode

从图5可以看出，这2种人参稀有皂苷在ESI-模式下通过Q/TOF均得到离子峰m/z=665。该离子峰为[Rk3+HCOOH]-离子峰，而负离子模式下又减少一个H；因此，这2种物质的相对分子质量均为620。与人参稀有皂苷Rk3和Rh4相对分子质量相同。由此证明，Rh1组样品中含有人参稀有皂苷Rk3和Rh4。

由图4和5可知，Rh1组中含有预测的4种人参稀有皂苷异构体20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3、Rh4。

2.3高效液相色谱分析Rh1组分

利用HPLC确定Rh1组中4种异构体或质量比，结果如图6所示。

图6　红参皂苷Rh1组的HPLC检测图谱

从图6中可以看出，Rh1组中有4种人参皂苷，通过与标准品的保留时间对照，可初步判断Rh1组中含有人参皂苷20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3、Rh4；保留时间依次为38.966，39.517，46.194，46.932 min；4种异构的总质量分数在90%以上，具体数据见表1。

表1　Rh1组HPLC图的数据分析

Tab.1　Data analysis of Rh1 group in HPLC

从图6、表1中可以看出，Rh1组中含有4种人参皂苷20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3、Rh4，质量比为25.0∶18.8∶15.5∶40.7。

3结论

红参皂苷Rh1组在TLC图谱中有2个斑点，推测上斑点可能为Rk3和Rh4皂苷的混合物，下斑点可能为20(S)-Rh1和20(R)-Rh1异构体的混合物；经UPLC-MS分析，进一步确认红参皂苷Rh1组含有4种异构体，分别是20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3和Rk4；高效液相色谱检测结果表明，红参皂苷Rh1组中4种异构体20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3、Rh4的质量比为25.0∶18.8∶15.5∶40.7，4种异构体总质量分数在90%以上。

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Preparation and analysis of ginsenoside Rh1 products from biotransformation

WANGXiaobing,LIUChunying,WANGShang,YUHongshan,JINFengxie

( School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

Abstract:After analysis using TLC, UPLC-MS and HPLC, Rh1 group showed two bands in TLC plate, one of which might be a mixture of Rk3 and Rh4 saponins, and other of which might be a mixture of 20(S)-Rh1 and 20(R)-Rh1. UPLC-MS showed that the red ginseng ginsenoside Rh1 group contained four isomers such as 20(S)-Rh1, 20(R)-Rh1, Rk3 and Rk4, the mass fraction of which was 25.0∶18.8∶15.5∶40.7. The total mass fraction in the Rh1 products was more than 90%.

Key words:ginsenoside Rh1 group; isomers; HPLC; UPLC-MS

作者简介:王肖冰(1991-)，女，硕士研究生；通信作者：金凤燮(1945-)，男，教授.

基金项目:国家科技重大专项“新药研究开发关键技术研究”(2012ZX09503001-003).

收稿日期:2014-12-23.

中图分类号:TS201.2；Q284.2

文献标志码:A

文章编号:1674-1404(2016)01-0011-04