胰岛分离的研究进展

程颖（中国医科大学附属第一医院器官移植科，辽宁 沈阳 110001）

成功的胰岛移植可以将糖尿病患者的血糖水平维持在正常范围内，是临床治疗糖尿病的有效手段［1-2］。成功的β细胞代替治疗是使受者实现糖代谢正常，脱离外源性胰岛素，使糖化血红蛋白水平（haemoglobin A1c，HbA1c）恢复正常，减轻糖尿病诱导的器官衰竭以及降低因使用外源性胰岛素导致严重低血糖事件危及生命的风险。受者在接受胰岛移植后糖尿病的急性和慢性并发症将得到缓解，生活质量得到极大改善［3］。

与胰腺移植相比，胰岛移植具有并发症发生率低、手术简单的优势，但由于术后多数患者依赖胰岛素，临床没有大规模开展。20世纪末，胰岛分离技术的进步使其为临床胰岛移植项目在全球的发展打开了大门。在Edmonton方案中研究者为糖尿病患者移植多个供体的胰岛，通过使用低毒免疫抑制方案使7例受试者脱离了外源性胰岛［4］，取得了突破性进展。Edmonton方案也成为胰岛移植标准［5-6］。尽管胰岛移植取得了重大的进步，实现了移植术后脱离胰岛素治疗，但大多数受者体内移植胰岛随着时间的推移而被消耗，使胰岛移植后5年的胰岛素脱离率仅为10%。这种慢性胰岛移植物功能的衰减可能与移植物排斥反应和复发性自身免疫反应有关［7］。

胰岛分离纯化是胰岛移植的关键步骤，也是决定移植成败的关键。影响胰岛分离效果的因素很多，从供体脑死亡到胰岛分离过程中，很多环节都会损耗胰岛［8］。胰岛制备过程包括供体的筛选、胰腺消化、胰岛纯化及胰岛培养等。本文将阐述多种提高胰岛分离产量的方法。

1 供者的筛选

很多供体相关因素能够影响胰岛分离结果，包括年龄、致死原因、体重指数（body mass index，BMI）、冷缺血时间、住院治疗时间、血管活性药物的使用情况及血糖水平［9-15］。大多数情况下，较大的胰腺含有较多胰岛［16］。因此，胰腺的重量是供体胰岛的替代参数，一项研究通过分析345例供体信息得到了预测胰腺重量的公式［17］。研究发现∶① 男性的胰腺比女性更大；② 在40岁之前，胰腺重量随年龄而增加；③ BMI与胰腺重量之间存在相关性，但与BMI相比，体表面积能更好地预测胰腺重量［18-19］。实验研究发现，心脏死亡器官捐献（donation after cardiac death，DCD）来源的胰腺与脑死亡器官捐献（donation after brain death，DBD）来源的胰腺在分离胰岛的产量和功能上相似，但是临床试验与该结果不完全一致［20］。日本在DCD供体的器官移植方面经验丰富，他们在DCD供体来源的胰岛移植中报道了第1、2、3年的移植物存活率分别是76.5%、47.1%和33.6%，多次胰岛移植的存活率分别是100%、80.0%和57.1%。所有受者未发生严重低血糖事件，而且还有3例受体脱离胰岛素分别14、79和215天［21］，这表明在DBD来源受限的情况下，DCD可作为分离胰岛的重要来源。

2 胰腺组织的消化和酶

胰腺组织的消化采用酶消化分离法，将产生胰岛素的胰岛和胰腺的外分泌组织分离开。为了促进胰岛分离，需要将酶混合物灌注到胰岛和外分泌组织的间隙中，消化间隙的结构蛋白——胶原蛋白［22-23］。由于胶原蛋白的致密结构和机械强度，使其通常不能被普通的蛋白酶降解，但能被特异性高的胶原酶有效降解［24］。因此，胶原酶是分离胰岛的关键成分，但单独使用胶原酶不能充分消化胰腺组织［25］，这表明非胶原酶成分能促进胰腺的消化。在1990年之前，天然胶原酶是从溶组织梭菌发酵产物中提取出来的，广泛应用于胰岛分离中，这种胶原酶分为2个不同的级别∶CⅠ和CⅡ，包含不定量的淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、壳多糖酶、唾液酸酶、透明质酸酶、脂肪酶和磷脂酶［26-28］。因此，商品化的胶原酶在不同批次间具有成分和活性的差异，从而影响胰岛分离的成功率［29-30］。20世纪90年代末，罗氏公司开发了一种经纯化的混合酶——Liberase HI，它是由CⅠ和CⅡ组成，并且添加了一种从嗜热芽孢杆菌中提取的嗜热菌蛋白酶，减少了不同批次之间酶活性的差异。随后，Liberase HI应用于实验和临床的胰岛分离，提高了动物和人胰岛分离的产量和活性［31-32］。

溶组织梭菌有2个同源但不同的基因—ColG和 ColH，分别编码 CⅠ和 CⅡ［33-34］。CⅠ和 CⅡ在结构上完全不同，但这两种酶的催化作用基本一致［35］。一些研究者认为CⅡ是消化胰腺的关键酶而忽略了CⅠ的作用［36］。Kin等［37］的研究表明，与含CⅡ比例较高的酶相比，含CⅠ比例较高的酶能表现出更好的消化效果，研究还发现过多的CⅡ并不会促进人胰岛素的释放，而是需要CⅡ/CⅠ比值适当［38］。

深入研究胰岛和外分泌组织之间的结构和成分能促进胰腺消化方法的改进，先前的一些研究阐述了人胰腺内不同类型胶原蛋白的分布情况。胶原蛋白Ⅳ存于导管和腺泡之间的基底膜内［39］，胰岛和外分泌组织之间存在的胶原蛋白亚型有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ［40］。Hughes等［41］研究发现，成人胰腺的胰岛和外分泌组织之间的胶原蛋白类型主要是胶原蛋白Ⅵ。胶原蛋白Ⅵ含有大量的二硫键以保护其结构不易被胶原酶破坏［42］。胰腺胶原蛋白受正常衰老过程的影响，Bedossa等［43］发现超过50岁的受试者体内胰腺胶原蛋白的含量明显高于青年受试者。因此，对胶原蛋白的深入认识能助于对胰腺消化方法的改进。

2007年，人们发现Liberase胶原酶的生产过程中使用了含牛神经成分的物质，使胰岛移植具有潜在传染朊病毒的风险，很多胰岛移植中心出于安全考虑而换用Serva胶原酶，很大地影响了胰岛的产量和质量。比较使用Liberase HI 和Collagenase NB1分离人胰岛的结果发现，采用Liberase HI分离的人胰岛活性更佳［44-45］。采用高效液相色谱法和胶原蛋白降解活性实验分析了Liberase MTF、CIzyme Collagenase HA和Collagenase NB1，发现CIzyme Collagenase HA具有最强的胶原蛋白降解活性，其次 是 Liberase MTF 和 Collagenase NB1［46］。Balamurugan等［47］详细地评估了8种不同的酶组合使用对人胰岛分离产量的影响。这项研究中249例胰岛分离中用到的酶包括纯化和未经纯化的胶原酶（CⅠ和CⅡ），嗜热菌蛋白酶及中性蛋白酶。根据酶的生化特征和酶的消化能力，用CⅠ、CⅡ和中性蛋白酶的混合物代替嗜热菌蛋白酶配制成新的混合酶。与标准混合酶相比，使用这种新的混合酶能从胰腺炎和捐献的胰腺供体中分离出更多胰岛，并能保持良好的胰岛活性和功能。Qi等［48］对 Liberase HI、Collagenase NB1/NP 和 MTF C/T进行了研究，通过对比应用这3种酶分离胰岛的数量、活性、葡萄糖刺激的胰岛素分泌（glucosestimulated insulin secretion，GSIS）、葡萄糖刺激的耗氧量（glucose-stimulated oxygen consumption rate，ΔOCR）及小鼠胰岛移植的效果发现，采用MTF C/T分离胰岛的各项指标均优于采用Liberase HI 和Collagenase NB1/NP分离的胰岛。此外，还有相当多的研究致力于开发非酶的胰腺消化方法，不损伤胰岛而选择性地消化腺泡组织［49］，如采用双向电流非接触技术分离胰岛［50］。这些混合酶和非酶型的胰岛分离技术是否能在临床胰岛移植中应用以及能否改善治疗效果至今尚未阐明。

3 胰岛纯化

人的肝脏具有很强的再生能力和血管重建能力，因此可作为胰岛移植部位［51］，而平均每个人的胰腺（90 g）通过酶消化可以得到大于40 ml的胰腺组织，不能以较大组织量注入肝脏中。此外，大量的临床证据表明，将大量的组织颗粒注入肝脏中会立即引起肝栓塞、血栓、损伤甚至死亡［52］。显然，为了移植安全只有减少组织量才能将胰岛移植到肝脏内。这可以通过胰岛纯化的操作得到高纯度的胰岛来实现。

根据密度差异将胰岛从外分泌组织中分离出来是一种简单而有效的胰岛纯化方法。这种方法的理论基础是利用胰岛（＜1.059 g/ml）和外分泌组织（1.059～1.074 g/ml）之间的密度差异［53］，通过离心使胰岛和外分泌组织在连续密度梯度液中分布到自己的密度区间。理论上，胰岛和外分泌组织之间存在的密度差异能有效地分离胰岛。但是，会有部分胰岛没有完全和外分泌组织分离开，外分泌物质释放和组织水肿，使外分泌组织的密度下降而不能纯化分离到大量高纯度的胰岛。

COBE 2991的出现迅速提高了胰岛纯化的产量［54］。其中，最为常用的一种纯化介质是聚蔗糖。Scharp等［55］研究发现，去掉Ficoll中低分子量物质能提高胰岛纯化的产量。UW液能减少腺泡组织水肿［56-58］，Huang等［59］将UW液应用于胰岛纯化过程中，将UW液和泛影酸钠加入Ficoll 中制成密度梯度液用于分离胰岛，与之前的纯化液相比，明显提高了胰岛纯化的产量。之后，Barbaro等［60］将UW-Bicoll纯化方法进一步改良，采用一个较窄的密度区间纯化胰岛使其纯化效率达到85%。最近的研究发现，在纯化过程中应用OptiPrep能减少胰岛分泌的促炎因子和趋化因子，并在临床上取得不错的成效［61］。McCall等［62］对比了 Ficoll-，histopaque-，dextran-和碘克沙醇的胰岛纯化实验，发现使用histopaque不仅能纯化出胰岛而且花费最低，是一种经济可行的纯化方法。Shimoda等［63］采用了一种大瓶纯化技术，以ET-Kyoto和碘克沙醇作为纯化液，待纯化组织加在纯化液的上层，离心使胰岛和外分泌组织分离开。这种技术较传统的分离技术能提高胰岛的产量和活性。此外，一些其他的研究使用磁性分离胰岛［64］，尽管可以分离猪胰岛，且具有临床应用的潜力，但这项技术如何转化到临床应用至今尚未阐明。

4 胰岛培养

临床胰岛移植依赖于成功的人胰岛分离，然后通过体外培养维持胰岛功能直至实行移植手术。虽然在移植实验中是否应该立即将分离的胰岛实行移植有争议［65］，但将人胰岛培养一段时间后进行移植对于临床治疗是有益处的，能够为患者提供准备时间以及移植前的免疫治疗时间，并且在培养期间可以完成各种质量控制实验（如微生物学检测和热源检测实验）。一项非常重要的研究领域就是利用一些物质在培养过程中改善胰岛活性以及促进移植后的胰岛功能，如在培养液中加入抗氧化剂能成功地维持胰岛的完整性［66］。胰岛分离后极易受到缺氧的损伤［67］，另一项研究领域就是减少培养过程中的缺氧损伤。一些新的生物材料也应用于胰岛培养过程中改善胰岛活性，如细胞外基质（extracellular matrix，ECM）代替物为胰岛提供天然的微环境［68］，还有一些用ECM胰岛包被技术、生物支架和生物反应器等。

5 总 结

近几年，临床胰岛移植技术发展迅速以及免疫抑制治疗也取得了很大的进步，使胰岛移植受体的5年胰岛素脱离率达到60%［69］。目前的研究仍需致力于如何从供体中获得大量高活性的胰岛，使其在受体内长期维持调控血糖的功能。为了实现这一目标还需要付出更多努力，为糖尿病患者带来福音。