异种胰岛移植的现状

谢艳，王树森，2，3，刘蕾，2（.天津市第一中心医院器官移植中心，天津 30092；2.天津市器官移植重点实验室，天津 30092；3.卫生部危重病急救医学重点实验室，天津 30000）

随着2000年加拿大Edmonton方案的问世及推广，胰岛移植治疗1型糖尿病取得了鼓舞人心的临床效果。国际胰岛细胞移植登记处（collaborative islet transplant registry，CITR）自 1999 年 以 来 的864例单独胰岛细胞移植或肾移植后胰岛细胞移植患者胰岛素撤离患者比例从1999-2002年的27%上升到2007-2010年的44%［1］。有研究报道显示，胰岛移植后5年达到胰岛素撤离患者的比例为60%［2］。胰岛移植临床效果显著，且创伤性小，并发症发生率低，易被患者接受，但同种胰岛移植面临供体短缺的严重问题，这大大阻碍了临床同种胰岛移植的进程。猪胰岛细胞移植始于20世纪90年代，异种胰岛移植有望克服困难走向临床。本文就异种胰岛移植的现状进行简要综述。

1 异种胰岛移植的临床进展

1.1 第1例临床异种胰岛移植∶在大量动物实验的研究基础上，瑞典Uppsala大学Groth等［3］在1994年首次较为系统地进行了猪胰岛细胞移植到人体的临床试验。Groth等［3］将胎猪胰岛样细胞团（islet-like cellclusters，ICCs）移植给10例胰岛素依赖性糖尿病肾移植术后患者，其中8例患者ICCs植入门静脉，2例患者植入肾包膜下。所有受者给予抗胸腺细胞球蛋白或15-DSG进行免疫诱导和标准化维持治疗。将ICCs植入门静脉的4例患者尿液中检测到猪源性C肽释放且最长持续200～400天。对肾包膜下移植的1例患者进行活检，胰岛素和胰高血糖素染色均呈阳性。尽管患者每日所需胰岛素剂量并未减少，临床疗效也不明显，但这项研究首次证实了猪胰岛可以在人体内长期存活。

1.2 微囊化新生猪胰岛细胞移植∶Elliott等［4］通过腹腔镜将海藻酸钠微囊包裹新生猪胰岛细胞移植给1例1型糖尿病患者。患者共接受了1 305 000 IEQ胰岛细胞植入腹膜腔。移植术后12周，患者每日胰岛素剂量减少近30%，但移植后49周时又增加到移植前剂量。移植后11个月，尿中可检测到猪源性C肽。移植后14个月，糖化血红蛋白从移植前9.3%降低至7.8%。移植术后9.5年取活检，胰岛素和胰高血糖素免疫组化染色仍然呈阳性。在此之后，Scharp等［5］给7例1型糖尿病患者进行了1～3次海藻酸钠微囊包裹新生猪胰岛细胞移植，未见明显不良反应。其中5例患者的血糖水平有所改善，2例患者达到胰岛素撤离并持续32周。

1.3 新生猪胰岛细胞和猪Sertoli细胞联合移植∶Valdes-Gonzalez等［6］报道了12例青春期1型糖尿病患者进行新生猪胰岛细胞和猪Sertoli细胞联合移植的研究。先将2个内含聚四氯乙烯（PTFE）内芯的不锈钢筛网柱置于腹部皮下，两端封口，2个月后血管化的胶原纤维包绕该柱并沿筛孔长入。此时移去PTFE内芯，留下空腔，然后在此空腔内植入猪胰岛和新生猪Sertoli细胞。术后未使用任何免疫抑制剂，11例患者6～9个月后接受了第2次移植，其中6例患者每日所需胰岛素剂量减少。值得注意的是2例患者达到胰岛素撤离，平均糖化血红蛋白移植术前高于10%，移植术后低于10%，这表明新生猪睾丸Sertoli细胞对猪胰岛细胞具有保护作用，抑制异种移植排斥反应的发生。

尽管猪异种胰岛移植可以缓解同种移植供体短缺的问题，但目前临床异种移植效果仍不如同种异体移植，研究人员从猪胰岛细胞的供体来源、异种移植排斥反应的防治、移植部位的优化等方面探索改善异种移植临床效果的方法。

2 猪胰岛细胞的供体来源

供体猪的年龄对胰岛产量有很大影响。猪胰岛细胞的供体来源按不同年龄分为胎猪、新生猪（1～5 天）、幼猪（7～22天）、幼猪/成年猪（12～15周）、成年猪（＞2年）［7-8］。

胎猪和新生猪的胰岛结构与成年猪相差较大。尤其胎猪和新生猪结缔组织结构还未充分分化，通过酶消化分离胰岛细胞相对容易，分离出来的胰岛组织称为ICCs［9］。ICCs主要含内分泌组织，体外培养时内分泌组织可以存活而外分泌组织失去活性，因此，ICCs培养时便可纯化。但每只胎猪胰岛产量少于8 000 IEQ，新生猪胰岛产量为25 000 ～50 000 IEQ［8］。从移植手术到胰岛素分泌，ICCs需要历经一段较长的成熟期。据报道，每只幼猪的胰岛产量接近30 000 IEQ［8］，此外，胰岛细胞在培养期间便可成熟，幼猪的胰岛细胞移植后能立即分泌胰岛素［7，10］。幼猪/成年猪和成年猪的胰岛细胞容易破裂，很难分离出胰岛细胞，但分离的胰岛能立即分泌胰岛素。每只幼猪/成年猪的胰岛产量为80 000～150 000 IEQ，每只成年猪的胰岛产量为200 000～500 000 IEQ［8］。另一方面，胰岛细胞分离前维持供体猪在无指定病原体环境（designated pathogen free，DPF）中的费用昂贵，减少胰岛细胞分离前供体猪的培育时间能减少费用。因此，临床试验也多使用胎猪、新生猪或幼猪的胰腺［3，5-6，10］。

近几年，供体猪基因修饰成为研究热点，新出现的基因编辑技术使移植领域活跃起来。研究表明，成年猪Gal和hCD46敲除的基因修饰改善了移植物在STZ诱导的灵长类动物糖尿病模型中的存活情况［11］。近期诞生的新型基因工程猪，α1、3-Gal基因被敲除，使之表达人CD46（GTKO/CD46 pigs）、人组织因子途径抑制物、人CD39或猪CTLA4-lg［12］，将此新型猪胰岛细胞植入免疫抑制（STZ）诱导的5只糖尿病猴中，只有2只维持血糖水平正常超过5个月。也有研究显示，新生猪Gal基因敲除而表达CD55和hCD59的基因修饰减轻了STZ诱导狒狒的立即经血液介导的炎症反应（Instant blood mediated inflammatory reaction，IBMIR）［13］。

3 异种移植排斥

除了免疫抑制剂，临床已尝试用免疫隔离的方法使受体免于异种排斥。尽管还未取得临床突破性效果，但在灵长类动物糖尿病模型中已取得较大进步。Sertoli细胞与胰岛细胞联合移植是抵抗异种排斥较为独特的方法。

3.1 免疫抑制方法∶在灵长类动物糖尿病模型中，使用CD25和CD154特异性单克隆抗体、FTY720（或他克莫司）、依维莫司和来氟米特等免疫抑制剂可使成年猪胰岛移植物存活超过100天［14］。免疫病理学分析提示，灵长类动物模型对猪异种胰岛排斥是由细胞介导的。由于CD154特异性抗体在临床前期试验中曾发生血栓事件，因此CD154特异性抗体已不再用于临床试验。有研究致力于用CD40单克隆抗体替代CD154单克隆抗体，CD40特异性新型抗体共刺激可延长灵长类动物糖尿病模型中新生猪胰岛移植物的存活时间［15］。将50 000 IEQ/kg新生猪胰岛细胞通过门静脉植入6只切除胰腺的糖尿病猕猴中，免疫诱导治疗使用CD40特异性单克隆抗体和巴利昔单抗，用西罗莫司和贝拉西普维持治疗，结果显示，其中5只猕猴受体脱离胰岛素治疗，且未见血栓栓塞现象。进一步了解异种移植物排斥反应的独特机制，联合特异性的靶向治疗对异种胰岛移植排斥反应的防治具有重要意义。

3.2 免疫隔离方法∶胰岛免疫隔离方法是将胰岛细胞置于带有微孔的生物相容性半透膜制成的包囊内，允许水、电解质、糖类、胰岛素等小分子物质自由通过，阻止免疫活性细胞、免疫球蛋白、补体等大分子物质通过，使胰岛细胞与受体免疫系统隔离，从而避免移植排斥反应。Soon-Shiong等［16］首次报道了将微囊化胰岛移植用于1型糖尿病患者，按10 000 IEQ/kg的剂量移植到患者腹膜腔内，6个月后又按5 000 IEQ/kg的剂量进行第2次移植，患者达到胰岛素撤离持续9个月且未见不良反应。Tuch等［17］报道了4例1型糖尿病患者微囊化胰岛移植后持续30个月可检测到C肽，但在移植术后16个月时发现微囊周围纤维组织增生且胰岛坏死。尽管微囊化胰岛移植理论上是理想的免疫隔离方法且取得了一定的临床疗效，但微囊纤维化是阻碍其发展的重要原因。

3.3 猪Sertoli细胞联合移植∶自从墨西哥进行的临床试验显示出较好的效果，猪胰岛细胞和猪Sertoli细胞共同移植成为了研究热点［6，18］。Dufour等［19］的研究结果显示，新生猪Sertoli细胞可以在不使用免疫抑制剂的小鼠体内存活，且胰岛细胞和猪Sertoli细胞共同移植可以成功逆转糖尿病小鼠的血糖水平［20］。Takemoto等［21］研究发现，在不使用免疫抑制剂的情况下，猪Sertoli细胞和胰岛细胞共同移植可以逆转糖尿病小鼠的高血糖状态。尽管用猪胰岛和猪Sertoli细胞共同移植治疗糖尿病的研究取得了令人振奋的初步成果，但目前还没有足够的、可靠的灵长类动物糖尿病模型实验数据支持临床应用。

4 移植部位

门静脉是同种胰岛细胞移植的标准部位。由于肝脏是调节胰岛素水平的关键器官，部分肝病患者伴有糖尿病［22］。因此，将胰岛素直接分泌到肝脏是维持血糖水平较理想的方法［23］。与门静脉移植相比，腹膜内移植显示胰岛素分布延迟［24］。另外，通过门静脉移植所需胰岛细胞数量也比其他部位少。

但门静脉仍不是胰岛细胞移植最理想的部位，因为移植后短时间内植入的胰岛细胞超过一半失去功能［25］，且门静脉移植有出血、血栓形成、胆道穿孔、血清转氨酶一过性升高及动静脉瘘的风险。猪胰岛细胞通过腹膜内、皮下等部位移植均在灵长类动物糖尿病模型上进行过试验［26］。胰岛细胞纯化程度是选择移植部位的主要因素。纯度高的胰岛细胞主要通过门静脉移植，纯度低的胰岛细胞主要植入腹膜内，因为纯度低的胰岛细胞体积较大，需植入较大空间的部位［27］。临床同种胰岛细胞移植显示，腹膜内纯度低的胰岛细胞移植疗效比门静脉纯度高的胰岛细胞移植疗效差［17］。网膜囊内移植可以克服腹膜内移植的缺点。 网膜囊有丰富的血供，胰岛素以更接近生理的方式输入肝内，葡萄糖刺激胰岛素分泌反应也可能比腹膜移植有所改善，但网膜囊包被胰岛细胞需要特殊的外科技术［26］。皮下移植可以提供相对较大的空间，移植的胰岛细胞可以取回，但皮下移植血供差，胰岛素系统传输和外观问题是皮下移植的缺点［26］。

5 异种胰岛移植面临的伦理问题

异种胰岛移植将猪的胰岛细胞或经基因修饰的胰岛细胞植入人体，尽管猪与人胰岛素的氨基酸排列顺序接近，但有人认为，这将使人类与动物的生命体征之间的界限逐渐淡化，受者将面临人的完整性问题。

此外，异种胰岛移植存在跨物种感染风险。猪携带许多病原微生物，其中大多数在DPF培育下可以被清除［28］，但猪内源性逆转录病毒（porcine endogenous retrovirus，PERVs）存在于所有猪的基因组中，极难清除。Patience等［29］研究指出，猪细胞系PK-15与人细胞系HEK-293共同培养时，人细胞广泛感染 PERVs。van der Laan等［30］实验结果也显示，在培养液中猪胰岛细胞释放的PERVs可以感染人细胞。由于猪异种胰岛移植患者免疫系统受抑制，PERVs感染风险大大增加。有临床研究评估了来自160例接受多种活体猪组织或细胞移植的患者异种移植后PERVs的感染风险，包括体外灌注肝1例、体外灌注肾2例、生物人工肝28例、胰岛细胞14例、皮肤15例、体外灌注脾100例、随访12年时结果显示患者均未发生病毒血症且未感染PERVs［31］。目前没有发现人类感染PERVs的直接证据，但移植的安全性仍存在争议。

6 异种胰岛移植的展望

异种移植是解决器官移植供体短缺问题的主要途径之一，十几年前学者们就预言异种移植会首先在胰岛等细胞治疗上取得突破［30，32-33］。研究者通过选择适当猪龄的供体猪、寻找新的免疫抑制剂、改善免疫隔离的材料及寻找更好的移植部位等方法来提高猪胰岛移植效果，使这个预言逐渐成为现实。另外，通过基因编辑技术减少免疫反应及改善疗效也已经成为异种移植领域的研究热点［34］。近期，国际异种移植协会更新了1型糖尿病患者进行猪异种移植临床试验安全规范共识［35-42］。通过异种移植解决供体短缺的问题，胰岛细胞移植将有望成为糖尿病患者的标准疗法。