Wnt/β-catenin信号通路相关分子在肝癌靶向治疗中的研究进展

李圣杰，杨之斌

(昆明医科大学第三附属医院，昆明650118)



Wnt/β-catenin信号通路相关分子在肝癌靶向治疗中的研究进展

李圣杰，杨之斌

(昆明医科大学第三附属医院，昆明650118)

摘要：肝癌发病率及病死率均较高Wnt/β环连蛋白(β-catenin)信号通路中多个环节发生异常改变都可能与肝癌发生、发展密切相关，着力于该信号通路的靶向治疗成为研究的热点。目前，在肝癌中开展了以Wnt/β-catenin信号通路激活起始分子Wnt蛋白、胞膜Wnt受体和辅助受体、胞膜胞内信号传递衔接子、胞内复合体、核内转录复合体及信号通路抑制子为靶点的实验研究，应用前景广阔，但真正运用于临床尚需时日。

关键词：原发性肝癌；Wnt蛋白；β连环蛋白；信号通路；靶向治疗

目前，肝癌的发病机制仍不十分清楚，研究发现细胞信号转导对其发生、发展有着重要作用，其中有关Wnt/β连环蛋白(β-catenin)信号通路研究最多且相关机制解释较为清楚。Wnt/β-catenin通路由Wnt蛋白与跨膜受体结合，将Wnt信号传递至胞质蛋白，经过一系列的复杂反应致使胞内β-catenin水平增高，随后β-catenin发生核移位，与核内转录因子结合激活下游靶基因。其中，跨膜受体包括卷曲蛋白(Fzd)及低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6 (LRP5/6)，胞质蛋白包括散乱蛋白(Dvl)、结肠腺瘤样息肉病蛋白(APC)、酪蛋白激酶1(CK1)、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、轴蛋白(Axin)、β-catenin及泛素蛋白(Ub)等，核内转录因子主要包括转录活化因子(CBP)及T细胞转录因子/淋巴样增强因子(TCF/LEF)等，下游靶基因则有c-myc、细胞周期蛋白(cyclin) D1、survivin、gastrin、血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶(MMP)等。在多种高发性肿瘤中，Wnt/β-catenin信号通路都发挥了非常重要的作用，是肿瘤病理及靶向药物研究的热点。现将Wnt/β-catenin信号通路相关信号分子在肝癌靶向治疗中的研究进展作一综述。

1以信号通路激活起始分子Wnt蛋白为靶点

作为Wnt信号的起始分子，目前已知的Wnt蛋白有19种。Wnt蛋白在细胞生长分化、胚胎形成及肿瘤发生等过程中发挥着重要作用，抑制肿瘤Wnt蛋白与胞膜受体结合可作为有效的靶点[1]。Wei等[2]研究发现，抗Wnt-1抗体能够有效地抑制β-catenin/TCF4转录活性，下调其靶基因c-myc、cyclin D1、survivin的表达，在两种不同的肝癌细胞系中抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡，还能有效抑制裸鼠移植瘤的生长。

2以胞膜Wnt受体、辅助受体为靶点

Wnt受体Fzd是一类跨膜蛋白，由胞外区、跨膜区、胞内区构成，胞外区为一段半胱氨酸富集结构域，跨膜区是与G蛋白偶联受体类似的七螺旋跨膜结构，胞内段是羧基端区域。Wnt配体通过与Fzd胞外段结合改变膜受体构象将信号传递至胞内。Wnt辅助受体LRP5/6也由胞外区、跨膜区、胞内区结构，胞外区能协同Fzd将胞外信号传递至胞内，胞内区可招募骨架蛋白(如Axin)并使其降解，促进β-catenin的胞内聚集[3]。研究证明，治疗性单克隆抗体能够有效结合Wnt受体的胞外域，通过切断受体、配体的结合来阻断Wnt信号的传递，因此，Fzd以及LRP5/6蛋白都是这类治疗方式的潜在靶点。Gurney等[4]发现一种OMP-18R5单克隆抗体能够与Fzd1、Fzd2、Fzd5、Fzd7、Fzd8胞外段紧密结合，阻断绝大多数起始于Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a等多种Wnt蛋白的致癌效应信号，降低LRP6胞内段的磷酸化及β-catenin的胞内聚集，明显抑制裸鼠移植瘤的生长。目前，美国OncoMed公司正进行OMP-18R5的临床一期试验。另外一种特异性靶向结合Fzd8的单克隆抗体OMP-54F28[5]则能阻断所有的Wnt配体与Fzd8结合，从而阻断Wnt信号传递，其一期临床试验正由拜耳公司着手进行。此外，Wei等[6]发现，可溶性Fzd7能够与胞外Wnt3a配体结合，竞争性抑制Wnt3a配体与胞膜Fzd7受体结合，抑制Wnt/β-catenin信号传递，降低肝癌细胞生存能力，正常肝细胞却不受影响，并且还能增强阿霉素对肝癌细胞的抗增殖效应。

3以胞膜胞内信号传递衔接子Dvl为靶点

Dvl是将Wnt信号从胞膜传递到胞内的关键蛋白，其含有3个保守的功能结构域，即N端DIX结构域、核心PDZ结构域、C端DEP结构域。DIX结构域介导Dvl在受到Wnt信号刺激后发生聚集[7]；DEP结构域在调节上皮细胞平面极性功能时保障与细胞膜上脂类紧密结合[8]；PDZ结构域能与Fzd胞内段直接结合，抑制GSK-3β活性，β-catenin的磷酸化过程受抑制，非磷酸化的β-catenin在胞内聚集，从而将Wnt信号从胞膜传递到胞内[9]。鉴于Dvl的PDZ结构域与Fzd胞内段在Wnt/β-catenin信号传递中起到重要的衔接作用，因此PDZ结构能够作为理想的药物靶标。Dapper蛋白可以与Dvl的PDZ结构域结合，致使Dvl溶解，从而阻断Dvl与Fzd结合[10]。类似于Dapper蛋白，一些小分子化合物例如NSC668036、J01-017a、3289-8625能与Dvl的PDZ结构域结合，抑制Wnt/β-catenin信号传递。

4以胞内复合体为靶点

Wnt信号通路中关键枢纽分子β-catenin由胞质向胞核的转位是该信号通路被激活后行使功能的标志。Tien等[11]研究表明，β-catenin在肝癌细胞中表达阳性率高，细胞膜上表达高于细胞质内表达，在中、低分化肝癌的胞核中存在β-catenin的表达。胞质内的β-catenin与GSK-3β、APC、Axin、CK1构成的破坏复合体能介导β-catenin在胞内被降解而处于较低的水平，当该复合体受到破坏时β-catenin在胞内大量集聚，进而入核激活靶基因，因此胞内β-catenin的水平在Wnt信号通路起着决定性作用[12]。降低胞质内β-catenin水平及抑制胞质内β-catenin向核内转移能有效抑制肿瘤发生、发展，是抗癌治疗研究的重要分子靶位。Axin与APC在该复合体中扮演了骨架蛋白的作用，其他4种蛋白与之结合形成复合体，Axin、GSK-3β、CK1能调控β-catenin磷酸化促进其泛素化降解过程。Li等[13]研究发现，野生型Axin基因过表达能抑制肝癌细胞系的生长，促进其凋亡，下调cyclin水平，负向调控β-catenin转录活性。有研究证实，小分子FH535能够直接降低β-catenin水平从而抑制肝癌HepG2细胞增殖[14]。扑蛲灵(Pyrvinium)被认为是CK1激活剂，能促进β-catenin的泛素化降解过程[15]；然而，也有研究称Pyrvinium对CK1并无直接激活作用，而是通过下调Akt/PKB及激活GSK-3β来调控β-catenin的泛素化降解[16]。Wang等[17]用小分子干扰RNA沉默β-catenin的表达后能促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤血管生成。最近Gai等[18]发现，蟾毒灵(bufalin)能抑制GSK-3β上第9位丝氨酸残基的磷酸化，从而降低β-catenin及其下游因子cyclin D1、MMP-7以及环氧合酶2在胞质内的表达水平，明显降低肝癌细胞的增殖、侵袭及转移能力。

5以核内转录复合体为靶点

在细胞核中，β-catenin能与不同的DNA结合蛋白进行结合，进而重组染色质以调控转录程序。其中与β-catenin发生结合最重要的转录因子是TCF/LEF家族，包括TCF1、LEF1、TCF3、TCF4等。正常情况下核内缺乏β-catenin，阻遏蛋白如交互转导样增强子蛋白(TLE)和C端结合蛋白(CTBP)可与TCF/LEF相互作用，介导组蛋白去乙酰化和染色体固缩来抑制下游靶基因表达。下游靶基因如cyclin D1、survivin、PCNA、c-myc等一旦被激活，能发挥出不同级联的放大效应：cyclin D1和PNCA一起调控着细胞从G1期进入S期；c-myc过表达则能维持肿瘤不断生长并抵抗凋亡；survivin则主要介导肿瘤抗凋亡。由于β-catenin本身并不直接参与转录调控，而是通过与转录因子相互作用实现对下游相关基因表达的调控，因此抑制β-catenin与以TCF/LEF家族为代表的转录因子结合，阻碍调控转录复合体的形成，能阻断信号通路往下游继续发展，下游靶基因的表达受阻，从而抑制肿瘤进程。Wei等[19]研究证明，PKF118-310，PKF115-584，CGP049090能抑制β-catenin/TCF4与靶基因DAN序列结合，在体内外诱导肝癌细胞凋亡，将肿瘤细胞阻滞在G1/S期，并能明显抑制小鼠移植瘤模型肿瘤生长。

6以信号通路抑制子为靶点

Wnt抑制蛋白1(WIF1)、分泌型卷曲蛋白相关蛋白(sFRP)能与Wnt配体结合，阻碍Wnt配体与膜Fzd受体结合，Dickkopf1(Dkk1)则能与能与LRP5/6结合抑制Wnt信号向下游传递。Hu等[20]用携带WIF1、sFRP基因的重组腺病毒转染肝癌细胞，转染后的细胞能稳定表达WIF1及 sFRP，并下调了E2F1、cyclin D1、c-myc等基因的表达，促进肝癌细胞凋亡，抑制细胞增殖，延长实验动物生存期，说明WIF1、sFRP能够抑制Wnt信号通路抑制肝癌进展。而Dkk1的肿瘤生物学特性至今存在争议，一些研究提示Dkk1有抑制或促进肿瘤发生、发展的两面性特征：一方面Dkk1被认为是肿瘤发生、发展的抑制子，例如González-Sancho等[21]研究发现Dkk1在结肠癌中低表达，提示Dkk1或许起到了肿瘤抑制子的作用；上调Dkk1的水平后，肠癌细胞的增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力明显降低。另一方面Dkk1在非小细胞肺癌、小细胞肺癌、食管鳞状细胞癌、乳腺癌、膀胱癌中呈现高表达水平；而消减了Dkk1表达后，肝内胆管细胞癌细胞转移、侵袭能力明显减弱。Chen等[22]发现，Dkk1在肝癌细胞中高表达，上调Dkk1水平对肝癌细胞增殖、克隆形成能力并无影响，但可以上调β-catenin及MMP-7促进其转移、侵袭能力。因此，对于Dkk1所扮演的角色我们仍需进一步研究探索。

探索肝癌新疗法一直是肝癌研究领域的热点，然而肝癌靶向药物治疗现状仍不容乐观。目前，仅有索拉菲尼一种靶向药物受到FDA批准用于肝癌的治疗，但由于其价格昂贵、不良反应多及患者耐药性的产生，使其应用非常局限。Wnt/β-catenin信号通路在肝癌发生、发展中起重要作用，基于该信号通路在肝癌靶向治疗的研究有很多，前景虽广阔，但要真正运用于临床仍有很长的路要走。只有对肝癌的发生、发展更加深入的认识，尽可能详尽地阐述Wnt/β-catenin信号通路与其他信号通路之间的关系，宏观调控，精准导向，也许不久的将来会给肝癌患者带来福音。

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(收稿日期：2016-01-07)

中图分类号：R735.7

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)10-0099-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.10.045

通信作者：杨之斌(E-mail: yzblbab@vip.sina.com)

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81560472)；云南省卫生厅内设机构基金资助项目(2014NS017，2014NS018)；云南省卫生厅昆医联合专项(2013FB166)。