细胞自噬在儿童急性B淋巴细胞白血病化疗抵抗中的作用

苏莉，吕壮伟，苏敏

(1新乡医学院第二附属医院，河南新乡453003；2新乡医学院第三附属医院)



细胞自噬在儿童急性B淋巴细胞白血病化疗抵抗中的作用

苏莉1，吕壮伟2，苏敏1

(1新乡医学院第二附属医院，河南新乡453003；2新乡医学院第三附属医院)

摘要：目的以长春新碱(VCR)处理的人急性B淋巴细胞白血病细胞(BLCs)为模型，研究细胞自噬在儿童急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)化疗中的作用。方法将BLCs随机分为对照组、药物组、阻断组和联合组，分别加入等体积的PBS、1 μg/mL的VCR、10 mmol/L的细胞自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)、1 μg/mL的VCR+10 mmol/L的3-MA处理48 h，采用WST-1法测算细胞增殖抑制率，免疫印迹法检测自噬相关蛋白轻链3β(LC3β)。结果处理细胞48 h后，药物组、阻断组和联合组细胞增殖抑制率分别为9.7%±3.3%、63.4%±9.1%、80.6%±8.3%；各组间两两比较，P均<0.01。对照组、药物组、阻断组和联合组LC3β蛋白表达量分别为0.02±0.01、0.31±0.05、0.01±0.01、0.02±0.01，药物组高于其他组(P均<0.01)，其余各组间比较无统计学意义。结论细胞自噬可在ALL化疗过程中活化导致化疗抵抗。

关键词：急性淋巴细胞白血病；细胞自噬；自噬相关蛋白轻链3β；化学疗法；耐药；3-甲基腺嘌呤；儿童

细胞自噬是一种生理调节和进化保守的过程，在真核细胞胞质蛋白和大分子物质降解中起关键作用。尽管自噬在一些疾病尤其是感染性疾病中发挥抗感染作用[1]，甚至在免疫系统发育中也起关键作用[2]；但研究也表明，自噬经常在化疗或放疗的肿瘤细胞中激活[3]，这可能是肿瘤细胞应对治疗并生存的一种策略，因此自噬可能是肿瘤治疗的一个靶向[4]。急性淋巴细胞白血病(ALL)是儿童时期最常见的一类白血病，联合化疗后仍有约20%的患儿因高度耐药而复发，尤其是急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)。过去认为，这是治疗后一些耐药基因如多药耐药基因高表达的后果[5]，但常在治疗后活化的细胞自噬与儿童ALL药物抵抗是否有关尚不十分清楚。2014年1月～2015年6月，我们以长春新碱(VCR)处理的人急性B淋巴细胞白血病细胞(BLCs)为模型，研究细胞自噬在儿童B-ALL化疗过程中的作用。

1材料与方法

1.1材料BLCs与培养试剂，ECL发光试剂盒，WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒，均购自碧云天生物技术有限公司；兔抗人自噬相关蛋白轻链3β(LC3β)、β-actin单克隆抗体购自Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗、HRP标记羊抗鼠二抗购自北京中杉公司；CD19-FITC及同型对照、Alexa647标记的羊抗兔二抗购自BD公司；长春新碱(VCR)、细胞自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)购自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1BLCs增殖情况观察96孔板加入BLCs细胞5×103/孔(100 μL)，随机分为对照组、药物组、阻断组和联合组，分别加入等体积的PBS、1 μg/mL的VCR[6]、10 mmol/L的3-MA、1 μg/mL的VCR+10 mmol/L的3-MA，每组8个复孔。处理48 h后采用WST-1法检测细胞吸光度(A)值，按试剂盒说明书操作；实验重复3次，取平均值。细胞增殖抑制率=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%。

1.2.2BLCs中LC3β蛋白检测于24孔板加入5×105/mL的BLCs细胞悬液1 mL，其分组与处理同1.2.1。处理48 h后提取蛋白，采用免疫印迹法检测β-actin及LC3β蛋白；一抗1∶1 000稀释，4 ℃过夜；二抗1∶1 000稀释，室温孵育1.5 h；ECL发光后拍照，以LC3β与β-actin蛋白条带光密度比值表示目的蛋白相对表达量。

2结果

2.1各组细胞增殖抑制率比较处理细胞48 h后，药物组、阻断组和联合组细胞增殖抑制率分别为9.7%±3.3%、63.4%±9.1%、80.6%±8.3%；组间两两比较，P均<0.01。

2.2各组LC3蛋白表达量比较处理细胞48 h后，对照组、药物组、阻断组和联合组LC3蛋白表达量分别为0.02±0.01、0.31±0.05、0.01±0.01、0.02±0.01，药物组高于其他组(P均<0.01)，其余各组间比较无统计学意义。

3讨论

细胞自噬是目前生命科学研究的热点之一，尤其是在肿瘤和应激方面。虽然研究发现了一些自噬标志性的基因如LC3β[7]，以及一些重要的参与自噬的基因如高迁移率族蛋白1[8]，但是自噬在肿瘤细胞中的作用没有得到很好的解释，尤其是当受到各种应激压力时，包括化疗。Tang等[6]研究显示，抗癌药物VCR可通过氧化-还原调节胰腺癌细胞Panc02和结直肠癌细胞HCT116的自噬反应，影响其抗肿瘤疗效，这提示自噬是肿瘤化疗抵抗的关键因素之一。

LC3β是公认的细胞自噬的标志物，其功能涉及微管装配和细胞质中细胞器降解，在正常细胞中表达极少，但在应激、化疗等诱发的细胞自噬中均呈高表达。本实验在模拟ALL化疗的体外模型中发现，微管蛋白聚合抑制剂VCR处理BLCs后，一方面表现为强大的抗瘤能力，肿瘤细胞大量死亡；但是，另一方面也伴随着LC3β表达的逐渐增强，即化疗后诱导的细胞自噬活化。由于自噬的本质是细胞通过吞噬不必要的细胞器以保证细胞度过外界的应激，提示在ALL化疗中存在的细胞自噬可能是化疗抵抗的一个重要原因。研究表明，3-MA可通过抑制PI3K-mTOR信号通路抑制自噬的发生[9]。为了验证以上假说，本课题应用了细胞自噬的抑制剂3-MA，结果表明3-MA可明显抑制VCR诱导的自噬现象，同时伴有细胞增殖抑制率的明显升高，进一步说明了自噬是VCR诱导化疗抵抗的关键因素。研究发现，肿瘤细胞对化疗药物的应答主要有两条途径，其中一条是细胞凋亡，如一些氧化态蛋白的表达，进而诱导Caspase。在临床治疗ALL的过程中，尽管80%的患者可获得不错的疗效，但仍有少部分患者因化疗耐药而复发。研究已经表明，少量残存的肿瘤细胞是临床化疗后复发的一个重要因素[10]。结合本实验，我们认为ALL化疗失败患者可能是因为化疗时肿瘤细胞自噬活化，少量肿瘤细胞因此度过化疗，化疗结束后又大量扩增，进而造成临床上的耐药复发。

抑制细胞自噬，进而提高血液肿瘤化疗效果，可能成为未来血液肿瘤治疗的靶点[11]。虽然本实验发现了ALL治疗过程中存在着因细胞自噬而发生的化疗抵抗，可能是耐药复发的关键因素，但仍需要进一步研究导致自噬在化疗中激活的分子机制，例如PI3K-mTOR信号通路[12]、NF-κB途径[13]，这将为靶向自噬的新型药物在临床应用提供依据。

参考文献：

[1] Deretic V. Autophagy in immunity and cell-autonomous defense against intracellular microbes[J]. Immunol Rev, 2013,240(1):92-104.

[2] Arsov I, Adebayo A, Kucerova-Levisohn M, et al. A role for autophagic protein beclin 1 early in lymphocyte development[J]. J Immunol, 2015,186(4):2201-2209.

[3] Grandér D, Panaretakis T. Autophagy: cancer therapy′s friend or foe[J]. Future Med Chem, 2010,2(2):285-297.

[4] Ní Cheallaigh C, Keane J, Lavelle EC, et al. Autophagy in the immune response to tuberculosis: clinical perspectives[J]. Clin Exp Immunol, 2013,164(3):291-300.

[5] Rao DN, Anuradha C, Vishnupriya S, et al. Association of an MDR1 gene (C3435T) polymorphism with acute leukemia in India[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2014,11(4):1063-1066.

[6] Tang D, Kang R, Cheh CW, et al. HMGB1 release and redox regulates autophagy and apoptosis in cancer cells[J]. Oncogene, 2013,29(38):5299-5310.

[7] Shpilka T, Weidberg H, Pietrokovski S, et al. Atg8: an autophagy-related ubiquitin-like protein family[J]. Genome Biol, 2011,12(7):226.

[8] Kang R, Livesey KM, Zeh HJ 3rd, et al. HMGB1 as an autophagy sensor in oxidative stress[J]. Autophagy, 2011,7(8):904-906.

[9] Wu YT, Tan HL, Shui G, et al. Dual role of 3-methyladenine in modulation of autophagy via different temporal patterns of inhibition on class I and III phosphoinositide 3-kinase[J]. J Biol Chem, 2014,285(14):10850-10861.

[10] 张志向，柴忆欢，何海龙，等.急性淋巴细胞白血病患儿骨髓微小残留病检测的临床意义[J].实用临床儿科杂志,2010,25(15):1133-1135.

[11] Puissant A, Robert G, Auberger P. Targeting autophagy to fight hematopoietic malignancies[J]. Cell Cycle, 2013,9(17):3470-3478.

[12] Sun H, Wang Z, Yakisich JS. Natural Products Targeting Autophagy via the PI3K/Akt/mTOR pathway as anticancer agents[J]. Anticancer Agents Med Chem, 2012,13(7):1048-1056.

[13] Criollo A, Chereau F, Malik SA, et al. Autophagy is required for the activation of NF-κB[J]. Cell Cycle, 2014,11(1):194-199.

Role of cellular autophagy in chemotherapy resistance of children with B-cell acute lymphocytic leukemia

SULi1,LYUZhuangwei,SUMin

(1TheSecondAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China)

Abstract:ObjectiveWe take the human B-cell acute lymphocytic leukemia cells (BLCs) treated with vincristine (VCR) as the models to investigate the role of cellular autophagy in chemotherapy resistance of childhood B-cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL).MethodsBLCs were randomly divided into the control group, experimental group, blocker group and union group, which were respectively treated with the same volume of PBS, 1 μg/mL VCR, 10 mmol/L 3-methyladenine (3-MA) and 1 μg/mL VCR+10 mmol/L 3-MA for 48 h. Transmission electron microscope was used to detect the autophagosome, WST-1 was employed to calculate the proliferation inhibitory rate and Western blotting was performed to detect the autophagy-related protein light chain 3β (LC3β) expression. ResultsThe inhibition rates after 48 h treatment in the experimental group, blocker group and union group were 9.7%±3.3%, 63.4%±9.1% and 80.6%±8.3%, respectively (all P<0.01). The LC3β expression in the control group, experimental group, blocker group and union group was 0.02±0.01, 0.31±0.05, 0.01±0.01 and 0.02±0.01, respectively, and the experimental group was higher than the other groups (all P<0.01), no significant difference was found among the other three groups. ConclusionAutophagy can be activated during chemotherapy of ALL, leading to chemotherapy resistance.

Key words:acute lymphoblastic leukemia; autophagy; autophagy-related protein light chain 3β; chemotherapy; drug-resistance; 3-methyladenine; child hood

(收稿日期：2015-10-24)

中图分类号：R557.4

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)10-0020-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.10.007

作者简介：第一苏莉(1975-)，女，硕士，主管检验技师，主要研究方向为血液病检验。E-mail: suli_1975@163.com

基金项目：河南省教育厅自然科学基金项目(13A310843)；新乡医学院重点研究领域招标课题项目(ZD2011-12)。