胰岛素样生长因子1受体对卵巢癌细胞增殖及化疗敏感性的影响

刘恩令，李君，周玉秀，王德华，糜若然

(1河北医科大学附属唐山市工人医院；河北唐山063000；2天津医科大学总医院)



胰岛素样生长因子1受体对卵巢癌细胞增殖及化疗敏感性的影响

刘恩令1，李君1，周玉秀1，王德华2，糜若然2

(1河北医科大学附属唐山市工人医院；河北唐山063000；2天津医科大学总医院)

摘要：目的观察胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)对卵巢癌细胞增殖及化疗敏感性的影响。方法将人卵巢癌HO8910PM细胞随机分为3组，A、B组分别转染IGF-1R siRNA及无义siRNA，C组不转染。采用实时PCR法检测IGF-1R mRNA，CCK-8法测定细胞增殖OD值，CCK-8法测定细胞对顺铂和卡铂半数有效抑制浓度(IC50)。结果转染48、72、96 h时，A组IGF-1R mRNA表达量均低于同时点B、C组(P均<0.05)；转染72、96 h 时，A组细胞增殖OD值低于同时点B、C组(P均<0.05)；转染48 h 时，A组细胞对顺铂和卡铂的IC50低于B、C组(P均<0.05)；B、C组上述指标比较，P均>0.05。结论IGF-1R可促进卵巢癌细胞增殖，降低卵巢癌细胞对顺铂、卡铂的化疗敏感性。

关键词：卵巢癌；胰岛素样生长因子1受体；细胞增殖；顺铂；卡铂；化疗敏感性

在细胞分化、增殖及个体的生长发育中，胰岛素样生长因子1(IGF-1)及其受体(IGF-1R)具有促进作用。IGF-1R不仅作用于正常细胞，在许多肿瘤细胞恶性表型形成和维持上起关键作用[1]。研究显示，IGF-1R在许多恶性肿瘤中呈高表达，其中在卵巢癌细胞亦呈高表达。化疗是治疗卵巢癌的重要手段，但部分患者对化疗不敏感，从而影响了化疗疗效。小干扰RNA(siRNA)利用同源性双链RNA诱发序列特异的转录后基因沉默，使mRNA发生降解，从而抑制相关蛋白表达[2]。2014年3月~2015年4月，我们采用siRNA技术沉默IGF-1R基因，旨在探讨IGF-1R对卵巢癌细胞增殖及对化疗敏感性的影响，为卵巢癌的靶向治疗提供依据。

1材料与方法

1.1材料人卵巢癌细胞株HO8910PM、RPMI 1640培养基(购自中国科学院)，Lipofectamine 2000脂质体、TRIzol试剂、dNTP、RNA酶抑制剂、小牛血清、细胞增殖/毒性检测试剂CCK-8、IGF-1R多克隆抗体、GAPDH、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔、抗鼠IgG抗体、siRNA购自Invitrogen公司。IGF-1R siRNA序列及无义siRNA序列由上海生工合成。

1.2细胞培养将HO8910PM细胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基进行培养，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养；细胞融合率达80%时用0.25%胰酶消化，进行传代。将细胞以6×103/孔接种于96孔板，细胞贴壁后去除原培养液。

1.3细胞分组与转染将细胞按照3×103/孔接种于6孔板中，待细胞生长融合至30%~50%时随机分为3组，A、B组分别采用Lipofectamine 2000脂质体转染IGF-1R siRNA及无义siRNA，严格按照说明书操作，转染后继续培养48 h。C组不转染。

1.4细胞IGF-1R mRNA表达检测采用实时PCR法。分别于培养48、72、96 h取各组细胞，用TRIzol快速提取试剂盒提取总RNA，于-80 ℃存储。取2 μg总RNA，逆转录合成cDNA。反应体系：DEPC水5.3 μL，RT-PCR缓冲液2 μL，上下游引物各0.1 μL，RNA酶抑制剂0.1 μL，混合酶0.4 μL，底物1 μL。42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，-20 ℃保存。使用实时PCR试剂盒检测IGF-1R mRNA，以U6引物为内对照，RNA模板5 μL，2×Master Mix 25 μL，50×SYBR Green Ⅰ 1 μL，上下游引物各2 μL，DEPC水补齐至50 μL。95 ℃ 10 min，90 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s。采用2-ΔΔCt法计算IGF-1R mRNA相对表达量。

1.5细胞增殖活力测定采用CCK-8法。取各组细胞按6×103/孔接种96孔板，贴壁后去除培养液，更换为含1%胎牛血清的RPMI 1640培养基。于转染后48、72、96 h向每孔中加入10 μL的CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育2 h。用酶标仪于波长450 nm处测定光密度(OD)，以OD值表示细胞增殖活力。每组设6个复孔，取均值。

1.6细胞对化疗药物的半数有效抑制浓度(IC50)测定采用CCK-8法。取各组转染后48 h的细胞，依次加入终浓度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μg/mL的顺铂，终浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 μg/mL的卡铂处理48 h，向相应孔中加入10 μL的CCK-8溶液，在培养箱内继续孵育2 h，用酶标仪测定450 nm处的OD值，并使用软件计算顺铂、卡铂的IC50。

2结果

2.1各组细胞IGF-1R mRNA表达比较见表1。

表1　各组细胞IGF-1R mRNA表达比较

注：与B组比较，*P<0.05；与C组比较，#P<0.05。

2.2各组细胞增殖OD值比较见表2。

表2　各组细胞增殖OD值比较

注：与B组比较，*P<0.05；与C组比较，#P<0.05。

2.3各组细胞对顺铂、卡铂的IC50比较见表3。

表3　各组细胞对顺铂、卡铂的IC50比较

注：与B组比较，*P<0.05；与C组比较，#P<0.05。

3讨论

IGF家族由3个配体、4个受体及至少6种高亲和力的IGF结合蛋白组成。IGF-1是促有丝分裂生长因子家族成员，参与调节激素合成和分泌、细胞趋化迁移以及细胞免疫功能[3]。IGF-1R是位于细胞膜上的酪氨酸激酶受体，由2 个α亚基和2 个β亚基共价结合的多肽链组成。当配体与IGF-1R 的α亚基结合，引起β亚基构象改变，从而促进IGF-1R磷酸化，并参与胞内第二信使传递途径进而发挥其生物学功能[4]。IGF-1及其受体在肿瘤发生、发展中的作用备受重视，IGF-1通过与其受体结合而发挥功能，可促进细胞分化、增殖及抑制细胞凋亡[5]。多数肿瘤细胞可通过旁分泌、自分泌及内分泌形式产生IGF-1，其与受体结合发挥生长促进作用。正常情况下，IGF-1R的功能与调节细胞分化、生长及凋亡有关。近年来研究发现，许多肿瘤细胞系中发现IGF-1R基因表达失常，其异常表达在维持肿瘤表型方面起重要作用[6～9]。1991年,文献首次报道了卵巢癌细胞株表达IGF-1 mRNA、IGF-1R 和IGFBP。Eckstein等[10]证实，IGF-1R可诱导兔卵巢间皮细胞的表型转化和恶变。Brokaw等[11]发现，上皮性卵巢癌细胞中游离IGF-1高表达，证实了IGF-1在卵巢癌发展中的作用。IGF-1是通过受体发挥作用的，在上皮性卵巢癌组织中，IGF-1与IGF-1R表达呈正相关，表明卵巢癌局部表达上调的IGF-1与增多的IGF-1R相结合促进肿瘤细胞增殖。越来越多的研究表明，IGF-1在细胞增殖、分化、侵袭和血管生成方面发挥重要作用[12]。

IGF-1及其受体是癌症治疗的靶点。IGF-1R靶向治疗主要包括：①采用RNA干扰(RNAi)技术、反义寡核苷酸技术，靶向沉默IGF-1R基因，阻断其信号通路，抑制相关蛋白的表达；②合成IGF-1R 的单克隆抗体，利用该抗体对GF-1R 的高亲和力，可竞争性抑制IGF-1 与其受体的相互作用，即封锁配体-受体间的相互作用；③运用酪氨酸激酶抑制剂抑制IGF-1R 的激活，从而阻断其下游的信号通路[13]。siRNA是利用同源性双链RNA诱发序列特异的转录后基因沉默现象，通过使mRNA发生降解而抑制相关蛋白表达。RNAi技术高效、特异以及可遗传，可有效地沉默特定基因，为肿瘤的基因治疗提供了新方向。舒珊荣等[14]采用RNAi技术沉默IGF-1R基因对子宫内膜癌细胞增生及裸鼠成瘤的作用时发现，靶向IGF-1R 基因的siRNA可有效抑制IGF-1R基因表达，从而促使细胞凋亡，抑制细胞生长及成瘤作用。同时，研究发现采用siRNA沉默IGF-1R表达，通过抑制下游信号通路的传导，可增强子宫内膜癌对顺铂的化疗敏感性。本研究通过转染IGF-1R siRNA的方法，在卵巢癌HO8910PM细胞系中成功沉默了IGF-1R基因表达。转染72、96 h 时，A组细胞增殖OD值低于B、C组。这提示IGF-1通过IGF-1R途径对卵巢癌细胞系发挥促增殖作用,体外合成的IGF-1R siRNA可阻断这一途径,抑制肿瘤细胞增殖。转染48 h 时，A组细胞对对顺铂和卡铂的IC50值低于B、C组；证明IGF-1R对卵巢癌细胞的化疗敏感性有一定影响，体外合成IGF-1R siRNA使IGF-1R 表达降低，从而提高了卵巢癌细胞的化疗敏感性。张丁丁等[15]研究认为，IGF-1R参与了化疗耐药过程，但通过IGF-1R抑制剂NVP-AEW541抑制IGF-1R可逆转卵巢癌细胞对顺铂的耐药。

综上所述，IGF-1R可促进卵巢癌细胞增殖，降低卵巢癌细胞对顺铂、卡铂的化疗敏感性，而采用siRNA技术下调IGF-1R表达可逆转以上作用。

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Effect of insulin-like growth factor 1 receptor on cell proliferation and chemotherapy sensitivity of ovarian cancer

LIUEnling1,LIJun,ZHOUYuxiu,WANGDehua,MIRuoran

(1TangshanGongrenHospitalAffiliatedtoHebeiMedicalUniversity,Tangshan063000,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the insulin-like growth factor 1 receptor (IGF-1R) on cell proliferation and chemotherapy sensitivity of ovarian cancer.MethodsHuman ovarian cancer HO8910PM cells were randomly divided into 3 groups. Group A and B were respectively transfected by IGF-1R siRNA and nonsense siRNA, but group C without transfection. The real-time PCR was used to detect IGF-1R mRNA, CCK 8 was employed to detect OD value of cell proliferation, and CCK 8 was used to detect the effective inhibitory concentration (IC50) on cisplatin and carboplatin. ResultsAfter transfection for 48, 72 and 96 h, the expression of IGF-1R mRNA in the group A was lower than that of groups B and C (all P<0.05); at 72 h and 96 h, the OD value of group A was lower than those of groups B and C (all P<0.05); at 48 h, IC50value on cisplatin and carboplatin of group A was lower than those of groups B and C (all P<0.05). No significant difference was found between groups B and C (all P>0.05). ConclusionIGF-1R can promote the cell proliferation, and reduce the chemotherapy sensitivity of ovarian cancer cells to cisplatin and carboplatin.

Key words:ovarian carcinoma; insulin-like growth factor 1 receptor; cell proliferation; cisplatin; carboplatin; chemotherapy sensitivity

(收稿日期：2015-10-14)

中图分类号：R737.31

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)10-0017-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.10.006

通信作者简介：李君(1980-)，女，主治医师，主要研究方向为卵巢癌的耐药机制。E-mail: 45757875@qq.com

作者简介：第一刘恩令(1966-)，男，主任医师，主要研究方向为妇科肿瘤的基础与临床。E-mail: enling111@sina.com

基金项目：河北省医学科学研究重点课题计划项目(ZD20140384)。