人胰淀素和烟碱诱导相同离子通道的激活*

李秀凤，李宗明

1)漯河医学高等专科学校第三附属医院 漯河 462002　2)漯河医学高等专科学校神经生物学实验室 漯河 462002



人胰淀素和烟碱诱导相同离子通道的激活*

李秀凤1)，李宗明2)#

1)漯河医学高等专科学校第三附属医院 漯河 4620022)漯河医学高等专科学校神经生物学实验室 漯河 462002

关键词人胰淀素受体；烟碱乙酰胆碱受体；通道激活；阿尔茨海默病；大鼠

摘要目的：观察人胰淀素和烟碱对大鼠脑乙酰胆碱能神经元膜上受体通道活动的影响。方法：在急性分离的大鼠基底前脑神经元上，采用细胞贴附式和全细胞膜片钳技术进行检测。结果：人胰淀素或烟碱单独应用可以分别诱导相同通道的激活。烟碱与人胰淀素诱导的37 pS电导单通道电流幅度分别为(-3.6±0.4)和(-3.5±0.3) pA，65 pS电导单通道电流幅度分别为(-6.0±0.2)和(-6.1±0.3) pA,两电导水平的单通道电流比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)。在电流钳记录模式，人胰淀素或烟碱单独应用可引起神经元膜电位去极化并诱发动作电位的产生。DHβE完全阻断烟碱和人胰淀素的作用，应用人胰淀素受体拮抗剂AC253也观察到类似的效果。结论：人胰淀素受体和烟碱受体在中枢神经元存在功能性协同作用。

Same ion channel activation induced by human amylin and nicotine

LIXiufeng1)，LIZongming2)

1)TheThirdAffiliatedHospital,LuoheMedicalCollege,Luohe4620022)NeurobiologyLaboratory,LuoheMedicalCollege,Luohe462002

Key wordshuman amylin receptor;nicotinic acetylcholine receptor;channel activation;Alzheimer′s disease；rat

AbstractAim: To observe the channel activities of two receptors excited by human amylin and nicotine on rat brain acetylcholine neurons.Methods: The single channel cell-attached recordings and whole cell patch-clamp recordings were performed on acutely dissociated neurons of rat basal forebrain nucleus.Results: Either human amylin or nicotine individually caused the activation of the same channel. The smaller conductance(37 pS) single-channel current amplitudes induced by nicotine and amylin were (-3.6±0.4) and (-3.5±0.3) pA, respectively;the large conductance (65 pS) single-channel current amplitudes induced by them were (-6.0±0.2) and (-6.1±0.3) pA, respectively (P>0.05). Nicotine and amylin evoked the membrane depolarization and repeating action potential of neurons under current-clamp recording conditions. DHβE blocked the effects of nicotine and amylin. The similar effect was observed by using AC253.Conclusion: Human amylin and nicotine receptors functionally cooperate in the central neurons.

中枢神经系统的神经元之间的功能联系，是通过突触释放神经递质传递信息发生作用。由乙酰胆碱神经递质介导的效应，主要是通过烟碱乙酰胆碱受体发挥作用。烟碱乙酰胆碱受体在学习和记忆功能、神经元发育及一些神经退行性疾病方面起着重要的作用。研究[1]表明，老年痴呆症的一个重要病理特征是基底前脑胆碱能神经元的丢失，虽然这种选择性的胆碱能神经元丢失的确切机制尚未完全清楚，但一种可能的原因是胰腺B细胞产生的人胰淀素分泌减少，导致神经细胞兴奋性降低，最终导致胆碱能神经元死亡。在该研究中，作者采用膜片钳技术在急性分离的大鼠基底前脑神经元上观察人胰淀素和烟碱对细胞膜受体通道激活的影响，现将结果报道如下。

1材料与方法

1.2单个神经元的分离制备SD大鼠麻醉后，迅速断头取出脑组织，切取含基底前脑区的脑组织块，放入冰冷的人工脑脊液中。将脑组织块粘贴于载物台上，用切片机切成300 μm厚脑组织切片，脑组织切片包含了基底前脑区域。脑组织切片用胰蛋白酶处理25 min后(温度控制在30 ℃),用人工脑脊液洗3次, 然后用Pasteur吸管吹打分离出完整的神经元，分离出的单个神经元有明显的突起，细胞体饱满，立体感强，存活6 h以上。将分散的单个细胞接种于多聚L-赖氨酸涂层盖玻片上，放在倒置显微镜下观察和进行电生理记录。在整个操作过程中，细胞处于连续供氧状态。

1.3单通道电流和全细胞膜片钳记录单通道和全细胞膜片钳记录在室温(20～22 ℃)下进行，实验数据用Axopatch-700B放大器和Digidata1440A数据采集系统采集。记录电极用1.5 mm直径的薄壁玻璃经微电极拉制仪拉成，其电极阻抗为3～6 ΩM， 调整单通道记录电极内液pH值至7.2。10 nmol/L人胰淀素或10 nmol/L烟碱被加入电极管液中。全细胞电流钳模式电极管内液含K-methylsulfate 140 mmol/L，EGTA 10 mmol/L，MgCl25 mmol/L,CaCl21 mmol/L,HEPES 10 mmol/L,Na2-ATP 2.2 mmol/L，Na-GTP 0.3 mmol/L(pH值7.2)。单通道电流记录和全细胞记录采用低通滤波2 kHz，高通滤波10 kHz。对通道电流幅度、通道开放时间和关闭时间等进行记录，单通道电流的幅度、通道开放概率(Po)的估算采用Fetchan程序和Clampfit软件，只有振幅超过设定50%阈值的通道开放事件才被接受进行分析。全细胞记录包括电流钳和电压钳模式，应用桥式平衡或电容补偿确保记录信号的精确。当全细胞电压钳模式建立后，等待5 min使细胞稳定后，开始电压钳记录或者切换到电流钳记录模式。记录所获数据储存于计算机，然后用pCLAMP 10.0进行分析。

1.4统计学处理采用SPSS 17.0进行数据分析。烟碱组与人胰淀素组单通道电流幅度和Po的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；DHβE阻断人胰淀素诱发的内向电流和AC253 阻断烟碱诱发的内向电流的比较采用配对t检验。检验水准α=0.05。

2结果

2.1烟碱或人胰淀素诱发的单通道电流结果见表1、2。

表1　烟碱或人胰淀素诱导出对应于

2.2全细胞记录结果见表3。

3讨论

Aβ神经毒性是通过人胰淀素受体[2]起作用的，但确切的机制尚不清楚。该研究结果表明，烟碱和人胰淀素诱导的通道活动是相同的，并且胆碱受体拮抗剂DHβE可以阻断人胰淀素诱导的通道活动，同样，烟碱作用也可以被人胰淀素受体拮抗剂AC253阻断。这些说明胰淀素受体和烟碱乙酰胆碱受体在神经元细胞膜上存在着偶联作用[3]。有研究[4]显示Aβ通过作用于神经元膜上的人胰淀素受体，来影响在中枢神经系统内广泛表达的胆碱能受体，下调烟碱乙酰胆碱受体，加快神经退行性病变，导致早期阶段认知障碍。另外，有报道[5]显示在转基因AD小鼠中，STAT3阳性表达率最高的部位是基底前脑，其次是海马及小脑；STAT3是细胞信号传导途径中重要的核转录因子，它介导多种细胞因子和生长因子的信号向核内传导，影响靶基因的转录，调控细胞功能，对疾病的发生发展具有重要的调控作用[6]。

许多受体可以与受体活性修饰蛋白(RAMP)作用。RAMP与受体的相互作用可导致一系列效应，其中包括与受体蛋白结合运行至细胞表面产生新的受体表型。RAMP3是单一跨膜分子，当与降钙素受体结合时，其药学结构发生改变而成为胰淀素受体。进一步的研究[7]表明，RAMP在胞外有一个长的N端结构域，而在细胞内有一个短的C端结构域。这表明RAMP N端在重组的受体复合物耦合中起着重要作用[8]。在受体复合物被激活后，RAMP的C端决定信号转导通路。该研究结果间接提示烟碱乙酰胆碱受体和人胰淀素受体可能通过重组的RAMP受体复合物形成新的偶联。

该研究结果显示人胰淀素和烟碱激活相同的通道活动，这表明人胰淀素受体和烟碱乙酰胆碱受体在基底前脑神经元膜形成了一个偶联的受体复合物，刺激人胰淀素受体诱导构象变化，通过蛋白-蛋白之间的相互作用，直接影响细胞膜的烟碱乙酰胆碱受体。烟碱乙酰胆碱受体和人胰淀素受体复合体的N末端是激动剂和拮抗剂结合的位点。激动剂或拮抗剂与位点结合后，引起受体复合体发生结构的变化，调节细胞活性。两个看似不同的受体可以发挥协同作用，影响神经元的兴奋性。

综上所述，胰淀素受体激活后可通过与细胞膜的胆碱能受体偶联协同作用，影响细胞的活性，决定细胞的生与死，这对于理解阿尔茨海默病的发病机制非常有意义。

参考文献

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[2]JHAMANDAS JH,LI Z,WESTAWAY D,et al.Actions of β-amyloid protein on human neurons are expressed through the amylin receptor[J].Am J Pathol,2011,178(1):140

[3]LI ZM,LI XF.Functional coupling reactions of human amylin receptor and nicotinic acetylcholine receptors in rat brain neurons[J].Sheng Li Xue Bao,2012,64(1):69

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[5]田密,侯德仁,邓炎尧,等.STAT3与P-STAT3在转基因AD小鼠脑组织中的表达及意义[J].南方医科大学学报,2013,33(12):1778

[6]黄月,任秀花,张杰文,等.Aβ1-42单克隆抗体对阿尔茨海默病大鼠认知能力及脑组织Aβ和ChAT表达的影响[J].郑州大学学报(医学版),2011,46(1):88

[7]BOMBERGER JM,PARAMESARAN N,HALL CS,et al.Novel function for receptor activity-modifying proteins(RAMPs) in post-endocytic receptor trafficking[J].J Biol Chem,2005,280(10):9297

[8]PARAMESWARAN N,SPIELMAN WS.RAMPs:the past, present and future[J].Trends Biochem Sci,2006,31(11):631

中图分类号R338.8

#通信作者，男，1960年11月生，硕士，教授，研究方向：阿尔茨海默病，E-mail:lizongming3@126.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.014

*河南省教育厅基金资助项目2011C180007；漯河医学高等专科学校基金资助项目2010-S01