TM4SF1在人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231中的表达及其对细胞增殖、迁移能力的影响

张卫芳，孙　燕，张伟杰，朱　换，王留兴#

1)郑州大学第一附属医院肿瘤科一病区 郑州 450052　2)中国医学科学院肿瘤医院肿瘤内科 北京 100021



TM4SF1在人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231中的表达及其对细胞增殖、迁移能力的影响

张卫芳1)，孙燕2)，张伟杰1)，朱换1)，王留兴1)#

1)郑州大学第一附属医院肿瘤科一病区 郑州 4500522)中国医学科学院肿瘤医院肿瘤内科 北京 100021

关键词TM4SF1；乳腺癌；转染；细胞增殖；迁移

摘要目的：探讨TM4SF1在人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231中的表达情况以及靶向抑制TM4SF1基因后2种细胞的增殖、迁移能力的变化。方法：采用RT-PCR检测MCF-7和MDA-MB-231细胞中TM4SF1 mRNA表达情况，以正常乳腺上皮细胞MCF-10A的TM4SF1 mRNA表达作为参照；应用TM4SF1 siRNA瞬时转染MCF-7、MDA-MB-231细胞，应用Western blot方法分析转染效果和TM4SF1蛋白表达情况；CCK-8法检测沉默TM4SF1前后2种细胞增殖能力的变化；划痕实验检测细胞的迁移能力。结果：MCF-7细胞中TM4SF1 mRNA表达量为(1.159±0.218)，MDA-MB-231细胞中表达量为(1.396±0.199)，均高于MCF-10A细胞中的表达量(0.016±0.004)(P均<0.05)；且恶性程度较高的细胞MDA-MB-231高于低度恶性的MCF-7细胞(P<0.05)。特异性转染TM4SF1 siRNA后，该基因表达被抑制，同时MCF-7和MDA-MB-231细胞的体外迁移能力下降(P均<0.05)，而细胞的增殖能力变化差异无统计学意义(P>0.05)。结论：TM4SF1在人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231中高表达，并增强乳腺癌细胞的迁移能力。

Expression of TM4SF1 and its effect on proliferation and migration of human breast cancer cells MCF-7 and MDA-MB-231

ZHANGWeifang1),SUNYan2),ZHANGWeijie1),ZHUHuan1),WANGLiuxing1)

1)WardOneofOncology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)DepartmentofOncology,CancerHospital,ChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing100021

Key wordsTM4SF1;breast cancer;transfection;cell proliferation;migration

AbstractAim: To explore the expression of TM4SF1 mRNA in MCF-7 and MDA-MB-231 cells, and investigate its effect on the proliferation and migration when TM4SF1 was silenced.Methods: The expression of TM4SF1 mRNA in MCF-7 and MDA-MB-231 cells was determined by RT-PCR, and the results were compared with that of MCF-10A cells. RNA interference method was applied to transiently transfect siRNA targeting at TM4SF1 into MCF-7 and MDA-MB-231 cells, the transfection efficiency and the protein expression of TM4SF1 in MCF-7 and MDA-MB-231 cells were analyzed by Western blot, CCK-8 was used to measure the difference of cell proliferation when TM4SF1 was silenced,and the mobility was determined by the scratch test.Results: The expression of TM4SF1 mRNA in MCF-7 cells (1.159±0.218) and in MDA-MB-231 cells (1.396±0.199) were both significantly higher than the expression in MCF-10A cells (0.016±0.004)(P<0.05), and the expression of TM4SF1 mRNA in MDA-MB-231 cells was higher than that in MCF-7 cells (P<0.05). After the TM4SF1 siRNA was transfected into the cells，the TM4SF1 mRNA expression were significantly inhibited, while the capability of migration of the two cells were decreased(P<0.05), and the difference of cell proliferation had no significance(P>0.05).Conclusion: TM4SF1 is highly expressed in MCF-7 and MDA-MB-231 cells, and enhances the migration of the cells.

乳腺癌是女性最常见的肿瘤[1]。国内外研究[2]表明，TM4SF1与恶性肿瘤的血管形成密切相关，并可促进多种肿瘤的侵袭与转移。TM4SF1是四次跨膜蛋白L6超家族成员之一，在肺癌[3]、胰腺癌[4]、前列腺癌[5]等有异常高表达，在正常的血管内皮细胞呈低表达[6]。该研究通过检测人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231中TM4SF1表达情况，同时瞬时转染这2种细胞，检测细胞的增殖和迁移能力的变化，探讨TM4SF1与乳腺癌的关系，为乳腺癌的临床治疗提供一个新的靶点。

1材料与方法

1.1细胞株及主要材料MCF-7和MDA-MB-231细胞株由郑州大学肿瘤干细胞实验室提供，MCF-10A细胞由郑州大学第一附属医院重点实验室惠赠；RPMI 1640培养基购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；Lipofectamine2000、Trizol购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒购自美国罗氏生物制药有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计并合成；质粒siRNA由上海吉玛公司合成。TM4SF1-siRNA序列为5’-GGCUCUUGGUG GAAUUGAATT-3’(上游)，5’-UUCAAUUCCACCAA GAGCCTT-3’(下游)。NC序列为5’-UUCUC CGAACGUGUCACGUTT-3’(上游)，5’-ACGUGA CACGUUCGGAGAATT-3’(下游)。CCK-8购自日本同仁化学研究所；兔抗人TM4SF1抗体购自美国Abcam公司。

1.2细胞培养MCF-7、MDA-MB-231人乳腺癌细胞和MCF-10A细胞于37 ℃、体积分数5%CO2条件下，分别在含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640或DMEM/F12培养基中常规培养并传代。

1.4细胞总RNA的提取及RT-PCR检测3种细胞中TM4SF1 mRNA的表达Trizol法提取3种细胞总RNA，在冰上进行反转录后，行RT-PCR反应。TM4SF1引物序列为5’-TGCAGGATCTGGCTACT GTG-3’(上游)，5’-CAGTGCTGGCAAAGGTGTAG-3’(下游)，扩增产物大小104 bp；β-actin引物序列为5’-AGAAAATCTGGCACCACACC-3’(上游)，5’-CCATCTCTTGCTCGAAGTCC-3’(下游)，扩增产物大小435 bp。PCR反应体系：Real Master Mix 10 μL,引物(10 μmol/L)各0.4 μL,cDNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL,共20 μL。反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火与延伸10 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法计算3种细胞中TM4SF1 mRNA的相对表达量。实验重复3次。

1.6CCK-8法检测细胞增殖活性将细胞密度调整为2×104mL-1，接种于96孔板中(每组设6个复孔)，每孔加入100 μL，细胞贴壁后，按照前述方法瞬时转染，分别于转染后0、24、48、72 h，加入10 μL/孔的CCK-8溶液，培养箱中孵育1 h，用酶标仪测定450 nm处的吸光度值。重复3次，取均值，绘制细胞存活曲线。

1.7划痕实验检测2种细胞的迁移率将处于对数生长期的MCF-7、MDA-MB-231细胞接种于6孔板中，瞬时转染后待细胞融合度达到90%～100%时，用10 μL枪头对细胞做十字划痕，PBS洗去脱落的细胞，采用无血清RPMI 1640培养基培养，分别于0、24 h拍照，图像处理软件测量宽度，细胞迁移率=(1-实验组宽度/对照组宽度)×100%。重复3次，取均值。

1.8统计学处理应用SPSS 17.0进行数据分析。3种细胞TM4SF1 mRNA相对表达量的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；MCF-7和MDA-MB-231细胞TM4SF1基因沉默前后迁移率的比较采用两独立样本的t检验；SiNC组和SiTM4SF1组细胞增殖活力的比较采用两独立样本的t检验。检验水准α=0.05。

2结果

2.13种细胞TM4SF1 mRNA的表达正常乳腺上皮细胞MCF-10A TM4SF1 mRNA的相对表达量为(0.016±0.004)，MCF-7细胞TM4SF1 mRNA的相对表达量为(1.159±0.218)，MDA-MB-231细胞TM4SF1 mRNA的相对表达量为(1.396±0.199)(F=150.447，P<0.001)；且两两比较，差异均有统计学意义(P均<0.05)。转染SiTM4SF1的细胞TM4SF1 mRNA相对表达量较对照组和SiNC组下降，表明该基因被沉默(表1)。

表1　不同siRNA对2种

*：与对照组比较，P<0.05;#：与SiNC组比较，P<0.05。

2.2MCF-7和MDA-MB-231细胞TM4SF1蛋白的表达情况结果见图1，表明2种细胞已成功转染。

左：MCF-7细胞；右：MDA-MB-231细胞；1：对照组；2：SiNC组；3：SiTM4SF1组。图1　2种细胞TM4SF1蛋白的表达情况

2.3沉默TM4SF1基因对MCF-7、MDA-MB-231细胞增殖的影响结果见图2和表2、3。

图2　MCF-7 和 MDA-MB-231细胞TM4SF1基因沉默后细胞的存活曲线

表2　沉默TM4SF1基因后

表3　沉默TM4SF1基因后不同

2.4沉默TM4SF1基因对2种细胞迁移能力的影响结果见表4、图3。

表4　沉默TM4SF1 基因

1：0 h(×100)；2：24 h(×200)；A：MCF-7 SiNC组；B:MCF-7 SiTM4SF1组；C：MDA-MB-231 SiNC组；D:MDA-MB-231 SiTM4SF1组。图3　沉默TM4SF1基因后2种细胞迁移能力的变化

3讨论

近些年来，乳腺癌患者的5 a生存率明显提高，然而其复发和转移仍是需要解决的严峻问题，也是导致治疗失败和患者死亡的主要原因[6]。研究[7]表明，乳腺癌的复发与肿瘤血管的形成密切相关。而TM4SF1可以作为一个新的抑制肿瘤血管生成的靶点[8]。TM4SF1为四次跨膜蛋白L6超家族成员之一[2]，其家族成员还包括TM4SF4、TM4SF5、TM4SF18、TM4SF19、TM4SF20等。诸多研究[9-15]证实，TM4SF1蛋白在维持血管内皮细胞的功能和肿瘤血管形成中扮演着非常重要的角色，且靶向抑制该基因后，癌细胞的迁移和侵袭功能均明显下降。

该研究结果显示，TM4SF1 mRNA在三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和雌激素受体阳性乳腺癌细胞MCF-7中高表达，两者的表达水平明显高于人正常乳腺上皮细胞MCF-10A的表达水平，且MDA-MB-231细胞的表达水平高于MCF-7细胞的表达水平。特异性转染TM4SF1 siRNA后，其表达被显著抑制，同时2种癌细胞的体外迁移能力明显下降，而细胞的增殖能力无明显变化。基于该实验结果，作者推测TM4SF1基因可能和肿瘤细胞恶性程度的高低密切相关，未来可作为一种预测乳腺癌患者复发、转移的标志物。相关详细机制有待进一步研究。

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中图分类号R737.9

#通信作者，男，1952年2月生，教授，主任医师，研究方向：乳腺癌和前列腺癌的基础与临床，E-mail：wlx2246@126.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.025