HPLC法测定口腔溃疡含片(散)中靛蓝和靛玉红的含量

刘　越，罗定强，康　荣，张国跃，王国海

(1.陕西省食品药品检验所，陕西 西安　710065；2.西安医学院，陕西 西安　710021)



HPLC法测定口腔溃疡含片(散)中靛蓝和靛玉红的含量

刘越1，罗定强1，康荣2，张国跃1，王国海1

(1.陕西省食品药品检验所，陕西 西安710065；2.西安医学院，陕西 西安710021)

摘要:目的 优化样品处理过程，建立口腔溃疡含片(散)中同时测定靛蓝和靛玉红含量的方法。方法 以N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，进行超声提取；色谱柱：Welch C(18)(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇—0.02%磷酸溶液(65∶35)，流速：1 mL·min(-1)，检测波长：289 nm，柱温35℃。结果 靛蓝在69.12～1 728 ng范围内线性关系良好(r=0.999 5)，含片和散剂中靛蓝平均回收率分别为102.6%,RSD=1.0% (n=6)和96.6%，RSD=1.3% (n=6)，靛玉红在19.44～486 ng范围内线性关系良好(r=0.999 5)，含片和散剂中靛玉红平均回收率分别为102.3%,RSD=2.3% (n= 6)和101.5%，RSD=2.1% (n=6)。结论该方法准确、重现性好，并且可以同时测定靛蓝和靛玉红的含量，可用于口腔溃疡系列制剂中青黛的质量控制。

关键词:口腔溃疡含片(散)；提取溶剂；N，N-二甲基甲酰胺；靛蓝；靛玉红

口腔溃疡含片(散)由青黛、枯矾(白矾)、冰片三味中药组成，具有清热、消肿、止痛的功效[1]。口腔溃疡散标准最早收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第一册，标准号WS3-B-0017-89，现行标准收载于《中国药典》2015年版一部[2]。口腔溃疡含片是在口腔溃疡散的基础上改剂型而来，经国家局网站查询，口腔溃疡含片有两个生产厂家，分别执行两个标准，均源自于国家食品药品监督管理局标准。现行标准口腔溃疡散含量测定项下规定青黛是以靛玉红为指标性成分进行测定，而口腔溃疡含片是以靛蓝的含量进行计算，而靛蓝、靛玉红均为青黛药材中的主要药效成分[3-5]，为保证成药质量，应该对这两种成分同时进行测定。另外，靛蓝和靛玉红对溶剂的选择性要求较高，不同的样品处理方法导致其测定值差异较大，现行片剂质量标准含量测定项下，样品制备使用的溶剂为三氯甲烷或丙酮，而这两种溶剂对靛蓝的溶解性较差，使得对照品的配制及样品的提取存在一定问题，并且样品提取方法不合理，标准中规定将样品在索氏提取器中提取至无色，缺乏提取时间的量化指标。这些因素均影响测定结果的准确性。同时，在处方量、制成总量相同的情况下，片剂的含量测定限度也不一致，其靛蓝限度值每片分别为0.22 mg和0.5 mg。基于上述原因，有必要对口腔溃疡系列制剂的质量标准进行提高完善。

本研究重点选择优化提取溶剂以及样品制备过程，参考文献方法[6-12]，采用高效液相色谱法[13-14],同时测定口腔溃疡含片(散)中靛蓝和靛玉红的含量，能够较为全面地控制该系列制剂的质量。

1仪器与试药

1.1仪器岛津LC-20AD 高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器(日本岛津公司)；BS224S 电子分析天平、BP211D 电子分析天平(德国塞多利斯公司)；KQ-500DE 型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试药靛蓝和靛玉红标准品(中国食品药品检定研究院，批号分别为110716-201111和110717-200204；纯度分别为98.3%和100%，供含量测定用)；口腔溃疡散和口腔溃疡含片样品均来源于市场抽样，样品信息见表1；N，N-二甲基甲酰胺，三氯甲烷，丙酮，甲醇，乙酸乙酯，均为分析纯；甲醇(色谱纯，Merck)；水为超纯水。

表1　不同批次样品信息表

2方法与结果

2.1色谱条件色谱柱(Welch C18，5 μm，250 mm×4.6 mm)；流速1 mL·min-1；流动相：甲醇—0.02%磷酸溶液(65∶35)；柱温：35℃；检测波长：289 nm；分析时间40 min，进样量10 μL。理论板数按靛蓝峰计算不低于2 000，靛蓝峰与靛玉红峰的分离度应大于2.0。

2.2溶液配制

2.2.1对照品溶液配制 精密称取靛蓝对照品8.64 mg，置于25 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺使溶解，定容至刻度，摇匀，作为对照品储备溶液；精密称取靛玉红对照品9.72 mg，置于100 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺使溶解，定容至刻度，摇匀，作为对照品储备溶液；分别从靛蓝、靛玉红对照品储备溶液中精密量取10 mL溶液置于50 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺使溶解，定容至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液，其浓度分别为：69.12 mg·L-1和19.44 mg·L-1。

2.2.2供试品溶液配制 片剂：取本品10片，研细，取约0.6 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺约20 mL，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)10 min，放冷，加N，N-二甲基甲酰胺至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

散剂：取本品适量，研细，取约0.3 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺约20 mL，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)10 min，放冷，加N，N-二甲基甲酰胺至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3专属性试验取对照品溶液、供试品溶液、溶液按“2.1”项下色谱条件进样，见图1。

图1　专属性实验色谱图

注：A.混合对照品(1.靛蓝 2.靛玉红)；B.口腔溃疡散；C.口腔溃疡含片；D.散剂空白；E.片剂空白。

2.4线性范围考察分别精密吸取上述制备好的混合对照品溶液各1、2、5、10、20、25 μL，按上述色谱条件进行测定，以对照品的进样量(ng)为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，靛蓝回归方程为：Y=2 749X-82 539，r=0.999 5，靛玉红回归方程为：Y=1055X-13 327，r=0.999 5，结果表明，靛蓝在69.12～1 728 ng范围内线性关系良好，靛玉红在19.44～486 ng范围内线性关系良好。

2.5精密度试验 取同一供试品溶液，按照上述色谱条件，连续测定6 次，靛蓝和靛玉红峰面积的RSD分别为0.9 %和0.2 %。

2.6重复性试验 分别取样品编号1口腔溃疡散和编号6口腔溃疡含片，按着上述供试品溶液制备方法各平行制备6 份样品，按照上述色谱条件进行测定，计算得青黛中靛蓝和靛玉红的平均含量分别为6.213、0.883 mg·g-1，其RSD 分别为2.7% 和1.1 %(散剂)；3.466、0.236 mg·g-1，其RSD 分别为1.3% 和1.3 %(片剂)。结果表明：重复性良好。

2.7稳定性试验分别取样品编号1口腔溃疡散和编号6口腔溃疡含片，分别在0，2，4，8，12，18，24 h 进样测定，计算靛蓝和靛玉红峰面积的RSD 分别为2.4%、1.8%(散剂)和1.5%、2.7%(片剂)。结果表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.8回收率实验采用加样回收法，不同剂型分别精密加入不同量的靛蓝和靛玉红混合对照品溶液，挥干溶剂，再精密称取已知含量的编号1口腔溃疡散和编号6口腔溃疡含片供试品半量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液并测定，计算回收率，靛蓝、靛玉红平均回收率分别为96.6%、101. 5%、RSD 分别为1.3%、2.1%(散剂，见表2、3)和靛蓝、靛玉红平均回收率分别为102.6%、102. 3%、RSD 分别为1.0%、2.3%(片剂，见表4、5)，表明本法具有良好的加样回收率。

表2　口腔溃疡散中靛蓝回收率试验结果

表3　口腔溃疡散中靛玉红回收率试验结果

表4　口腔溃疡含片中靛蓝加样回收率试验结果

表5　口腔溃疡含片中靛玉红回收率试验结果

2.9含量测定按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定。对收集的4 个生产厂家10 批次口腔溃疡散、口腔溃疡含片中靛蓝和靛玉红的含量进行测定，结果见表6。

表6　口腔溃疡散(mg·g-1)、含片(mg/片)中靛蓝和靛玉红含量测定结果

注：— 现有标准方法未进行测定。

3讨论

3.1靛蓝和靛玉红对照品的溶解选择性现行标准中口腔溃疡含片含量测定项下，对照品溶液的配制分别为：精密称取靛蓝对照品适量，加丙酮制成每1 mL含2 μg的溶液或者精密称取靛蓝对照品适量，加三氯甲烷制成每1 mL含2 μg的溶液。存在的问题是作为溶解对照品靛蓝的溶剂，丙酮和三氯甲烷的溶解性都不是很好，但是由于靛蓝的化学特性，导致其对照品溶液具有深蓝的颜色，对判断其是否完全溶解造成了很大的干扰；这样的操作极易造成溶解不完全的现象，并可能导致含量测定值不准确的情况。口腔溃疡散含量测定项下，是使用甲醇溶解靛玉红，但是甲醇对靛蓝的溶解性较差。我们参考现有文献方法[6-12]并考察多种有机试剂，最终确定N，N-二甲基甲酰胺是对靛蓝和靛玉红对照品具有较好溶解性的试剂。

3.2含量测定结果分析现行标准中口腔溃疡含片含量测定项下，规定靛蓝的限定值为每片0.22 mg和0.5 mg，依据现行版《中国药典》青黛药材中靛蓝含量限度及片剂的处方和制法，片剂中靛蓝的理论限度值应为每片0.48 mg，从而得知现行的质量标准可能存在一定程度的不合理性。本实验方法建立的口腔溃疡含片(散)中靛蓝和靛玉红的含量测定方法与现行标准方法相比含量测定值有了较大的提高，并且可以同时测定靛蓝和靛玉红的含量，可用于口腔溃疡系列制剂中青黛的质量控制，也给其它含有青黛药材的中药复方的质量控制提供借鉴和参考。

参考文献：

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[2]国家药典委员会.中国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2015:505.

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[6]谢友良,何百寅,李远彬,等.青黛药材中的靛蓝和靛玉红含量的同时测[J].中药新药与临床药理,2011,22(4):452-455.

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Simultaneous determination of indigo and indirubin in Kou qiang kuiyang buccal tablets (powder)

LIU Yue1,LUO Ding-qiang1,KANG Rong2,et al

(1.ShaanxiInstituteforFoodandDrugControl,Xi’an710065,China;2.Xi’anMedicalUniversity,Xi’an710021,China)

Abstract:Objective To optimize the sampe pretreatment process and establish a HPLC method for simultaneous determination of indigo and indirubin in Kouqiang kuiyang buccal tablets (powder).Methods Sampes were prepared by ultrasonic extraction with N,N-Dimethylformamide; The Welch C(18) (250 mm×4.6 mm,5 μm) chromatographic column and the mobile phase of methanol-0.02% aqueous phosphoric acid (65∶35) were used for isocratic elution with the flow velocity at 1.0 mL·min(-1 )and the detective wavelength at 289 nm.ResultsThe linear correlation of the indigo was good in the range of 69.12～1728 ng and the recovery were 102.6 % (RSD=1.0%) (n=6) and 96.6 % (RSD=1.3%) (n=6),respectively. The linear correlation of the indirubin was good in the range of 19.44～486 ng and the recovery were 102.3% (RSD=2.3%) (n=6) and 101.5% (RSD=2.1%) (n=6),respectively.ConclusionThe method has advantages of good accuracy as well as reproducibility and can simultaneously determination of indigo and indirubin,which can be used the quality control of Kouqiang kuiyang buccal tablets (powder).

Key words:Kouqiang kuiyang buccal tablets (powder);extraction solvent;N,N-Dimethylformamide;indigo;indirubin

(收稿日期:2015-10-11,修回日期:2015-12-27)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.03.014

通信作者：罗定强，男，副主任药师，研究方向：中药质量控制，E-mail：luodq@sina.com