10 kDa以上幽门螺杆菌感染相关尿液差异表达蛋白的高效液相色谱-质谱分析*



10 kDa以上幽门螺杆菌感染相关尿液差异表达蛋白的高效液相色谱-质谱分析*

张慧芳#孟凡亮何利华张建中肖迪&

中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室(102206)

感染性疾病诊治协同创新中心

背景：除消化性溃疡和胃癌外，幽门螺杆菌(Hp)感染尚与多种胃肠外疾病密切相关。目前临床上尚无Hp感染的体液检测方法。目的：鉴定相对分子质量在10 kDa以上的Hp感染相关尿液差异表达蛋白，为Hp感染的体液诊断提供潜在生物学标记物。方法：志愿者留取晨起中段尿，并行13C-尿素呼气试验以明确Hp感染情况。Hp阴性和阳性尿液样本各取15例，分别混合后提取蛋白，以高效液相色谱-质谱系统分离蛋白、采集数据，行label-free定量分析。另取Hp阴性尿液样本15例和阳性尿液样本11例，对差异表达分析结果进行全扫描验证。应用IPA软件对鉴定出的尿液差异表达蛋白进行生物信息学分析。结果：Label-free定量分析共检测到475个尿液蛋白，并确定其中42个为差异表达蛋白。经外部扫描验证，最终鉴定出11个显著上调的差异表达蛋白。生物信息学分析揭示了这些差异表达蛋白的分子功能、参与的生物学通路、相关疾病等信息。结论：鉴定出的11个10 kDa以上尿液差异表达蛋白有望成为诊断Hp感染的生物学标记物，并可为Hp感染与胃肠外疾病的相关性研究提供分子水平的证据。

关键词幽门螺杆菌；尿；蛋白质组学；生物学标记；诊断

High Performance Liquid Chromatogram-Mass Spectrometry forHelicobacterpyloriInfection-associated Differentially Expressed Proteins in Urine with Relative Molecular Mass More than 10 kDa

ZHANGHuifang,MENGFanliang,HELihua,ZHANGJianzhong,XIAODi.

StateKeyLaboratoryofInfectiousDiseasePreventionandControl,NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing(102206);CollaborativeInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDiseases,Hangzhou

Correspondence to: XIAO Di, Email: xiaodi@icdc.cn

Background:Helicobacterpylori(Hp) is an important pathogen for peptic ulcer and gastric cancer, and is reportedly associated with a variety of extragastrointestinal diseases. However, there is no body fluid detection technique for Hp infection in clinical practice. Aims: To identify Hp infection-associated differentially expressed proteins in urine with relative molecular mass more than 10 kDa and provide potential biomarkers for diagnosis of Hp infection through body fluid detection. Methods: Midstream urine was collected from volunteers in the morning, and13C-urea breath test was performed to determine Hp infection. Each of 15 Hp-negative and 15 Hp-positive urine samples were mixed respectively for protein extraction. Spectra data were acquired by high performance liquid chromatogram-mass spectrometry, and label-free technology was used for relative quantitative analysis. The other 26 urine samples (15 Hp-negative and 11 Hp-positive) were used for validation by full scan. IPA software was employed for bioinformatics analysis. Results: A total of 475 urinary proteins were detected by label-free quantitative analysis and 42 differentially expressed proteins were identified. Finally, 11 significantly up-regulated differentially expressed proteins were confirmed by external scanning validation. Bioinformatics analysis revealed the molecular functions, biological pathways, and related diseases of these differentially expressed proteins. Conclusions: These 11 differentially expressed proteins more than 10 kDa identified in urine might be potential biomarkers for diagnosis of Hp infection and provide molecular evidence for the correlation of Hp infection with extragastrointestinal diseases.

Key wordsHelicobacterpylori;Urine;Proteomics;Biological Markers;Diagnosis

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori, Hp)是一种革兰阴性微需氧弯曲状杆菌，主要寄居于人体胃部，其为目前惟一明确对人类有致癌作用的细菌性病原微生物，已被WHO正式列为Ⅰ类致癌原[1]。近30年来的研究显示，Hp感染不仅可导致胃肠道疾病，而且与心血管疾病[2]、免疫系统疾病[3]、糖尿病[4]、肾病[5]、神经系统疾病[6]、血液系统疾病[7]、肝脏疾病[8]、皮肤疾病[9]等多种胃肠外疾病密切相关。目前临床上常用的非侵入性Hp感染检测方法主要有13C-尿素呼气试验(13C-UBT)、Hp粪便抗原检测(HpSA)等，13C-UBT敏感性高，但价格相对较高，HpSA则存在假阴性率过高的缺点；而侵入性的血清学Hp IgG检测只能判断既往感染，无法确定现症感染。

尿液成分较血液简单，易于获得且稳定性好，多种疾病相关代谢物均在尿液中有所体现，因此尿液蛋白质组学分析或可反映疾病早期的病理变化[10]，并成为寻找新的非侵入性疾病诊断标记物的理想途径[11-12]。本课题组前期研究[13]采用弱阳离子磁珠富集、高效液相色谱-质谱分析(HPLC-MS)分离鉴定、ClinProt系统数据采集和分析等一系列方法筛选出Hp感染患者尿液中相对分子质量在1～10 kDa(1 Da=0.992 1 u)范围内的多肽，发现了2个潜在的Hp感染相关尿液生物学标记物。本研究拟采用HPLC-MS和非标记(label-free)定量分析技术对相对分子质量在10 kDa以上的Hp感染相关尿液蛋白进行全面分析并确定Hp阳性与阴性组间差异表达蛋白，以期为Hp感染的体液诊断提供潜在生物学标记物，同时为探索Hp感染与胃肠外疾病的相关性提供分子水平的线索。

材料与方法

一、研究对象和尿液样本采集

研究对象为在校研究生志愿者，采样时间为2014年11月20日。为避免研究对象自身因素对尿液样本的影响，选择志愿者时剔除有糖尿病、肾病、心血管系统、免疫系统疾病史以及近一个月内使用过抗菌药物者，女性尿液样本采集时避开生理期。共入选志愿者60例，其中男26例，女34例，年龄20～35岁，平均23岁。入选者自愿完整填写调查表，按要求用统一提供的样品管留取晨起中段尿50 mL，并空腹行13C-UBT以明确Hp感染情况。尿液样本的采集和使用通过中国疾病预防控制中心传染病预防控制所伦理委员会审核，入选志愿者均签署知情同意书。

二、样本制备

尿液样本采集后4 ℃保存，2 h内12 000×g离心10 min，取上清液分装备用。选择Hp阴性尿液样本30例和Hp阳性尿液样本26例，各取15例用于差异表达蛋白分析，其余15例Hp阴性样本和11例Hp阳性样本用于差异表达蛋白验证。

用于差异表达蛋白分析的样本每例取50 μL，按Hp阴性和阳性分别混合成两个样本，采用丙酮沉淀法提取蛋白。主要步骤：以10 kDa超滤管超滤浓缩尿样，加入10倍体积-20 ℃含0.2%二硫苏糖醇(DTT)、20%三氯乙酸(TCA)的丙酮溶液，边加边搅拌，-20 ℃冰箱过夜；12 000×g4 ℃离心 15 min，弃上清液，水化液溶解沉淀，以25 mmol/L碳酸氢铵进行溶解液置换。使用Direct Detect红外微定量分析仪对蛋白样本进行定量，Hp阴性和阳性尿液蛋白样本各取100 μg，按1∶50的比例加入胰蛋白酶，37 ℃ 酶解过夜。用于验证的样本采用同样方法提取蛋白和酶解。

三、Label-free定量分析

1. 液相蛋白样本分离：每一尿液蛋白样本取3 μL 进样至纳升级EASY-nLC 1000液相色谱仪(Thermo Fisher Scientific Inc.)进行分离。预柱：PepMap 100，nanoViper C18，100 Å，5 μm，100 μm×2 cm；分析柱：PepMap 100，nanoViper C18，100 Å，3 μm，75 μm×25 cm。液相梯度设置：A相(99.9% H2O，0.1%甲酸)2 min，5%B相(99.9%乙腈，0.1% 甲酸)45 min，28%B相5 min，80%B相 8 min，流速均为 300 nL/min。

2. 质谱数据采集：使用与液相色谱仪串联的Q ExactiveTMPlus组合型四极杆OrbitrapTM质谱仪(Thermo Fisher Scientific Inc.)进行数据采集。以可加热电喷雾离子源(HESI)阳离子模式，Full MS/dd-MS2(TopN)串联模式采集数据。全扫描一级谱图范围m/z 350～1 600，分辨率70 000，最大积分时间250 ms，离子目标值3×106个。而后选择10个最强母离子进行二级数据采集，高能碰撞解离，分辨率17 500，最大积分时间120 ms，离子目标值2×105个。应用XcaliburTM软件(Version 3.0.63，Thermo Fisher Scientific Inc.)记录谱图。

3. 数据分析：应用Proteome DiscovererTM软件(Version 1.4，Thermo Fisher Scientific Inc.)搜索Swiss-Prot数据库。选择两个酶解漏切位点；半胱氨酸脲甲基化(carbamidomethyl)为固定修饰，蛋氨酸氧化(oxidation)为可变修饰；肽质量偏差为10 ppm，离子片段偏差为0.02 Da。以反转数据库去除假阳性鉴定。应用SIEVETM差异表达分析软件(Version 2.1，Thermo Fisher Scientific Inc.)对所有检测到的蛋白进行定量分析，定量前对所有样本原始谱图强度进行总离子流强度归一化处理。表达量变化超过两倍、方差分析P<0.05、重复数据原始质谱强度变异系数在30%以内且重复过程中未缺失任一数值的蛋白定义为差异表达蛋白。

四、差异表达蛋白验证

使用Q ExactiveTMPlus组合型四极杆OrbitrapTM质谱仪对26例验证用尿液蛋白样本进行全扫描，Proteome DiscovererTM软件进行蛋白检索确认，与差异表达分析结果进行比对，剔除假阳性结果。

五、生物信息学分析

应用IPA软件(Ingenuity Pathway Analysis Soft-ware)对鉴定出的尿液差异表达蛋白进行包括分子功能、参与的生物学通路、相互作用网络、与疾病的相关性等在内的生物信息学分析。

结果

一、差异表达蛋白鉴定

通过HPLC-MS/MS分析，选取95% CI范围内的肽段进行鉴定。Label-free定量分析共检测到475个尿液蛋白，并确定其中42个为差异表达蛋白(表1)。经26例尿液蛋白样本的外部扫描验证，最终鉴定出11个显著上调的差异表达蛋白，分别为木糖基转移酶1(xylosyltransferase 1)、肽聚糖识别蛋白1(peptidoglycan recognition protein 1)、α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶(alpha-N-acetylglucosaminidase)、神经分泌蛋白VGF(neurosecretory protein VGF)、凝溶胶蛋白(gelsolin)、原钙黏蛋白16(protocadherin-16)、凝聚素(clusterin)、内皮蛋白C受体(endothelial protein C receptor)、细胞黏附分子4(cell adhesion molecule 4)、生物素酶(biotinidase)和6-磷酸葡糖酸内酯酶(6-phosphogluconolactonase)。

二、差异表达蛋白生物信息学分析

通过IPA软件进行生物信息学分析，揭示了11个差异表达蛋白的分子功能、参与的生物学通路、相关疾病、体液分布、是否可作为疾病检测生物学标记物等信息(表2)及其参与的蛋白相互作用网络系统(图1)。

讨论

Hp感染是人类最常见的细菌感染之一，其与消化性溃疡和胃癌之间的密切联系已被公认。近年来，研究者对Hp感染与胃肠外疾病的相关性亦作了广泛的探讨，发现Hp感染在一定意义上可能是一种“全身性”疾病。研究显示Hp感染与心血管疾病有关[2]，高血清Hp IgG水平与高血清白细胞介素-6(IL-6)水平密切相关，可能在冠心病动脉粥样硬化中发挥关键作用[14]。Hp感染与糖尿病[4]、不明原因缺铁性贫血[7，15]、自身免疫性甲状腺疾病[16]、肝纤维化和肝硬化[8]、慢性阻塞性肺病[17]、精子活力降低[18]等疾病之间的相关性亦已得到阐述。Hp感染者存在Hp相关免疫紊乱，表现为血清类风湿因子、抗核抗体水平增高等，可能与自身免疫性疾病的发生和恶化有关[19]；根除Hp对特发性血小板减少性紫癜患者的轻度血小板减少有一定治疗作用[20]，能改善急性特发性中心性浆液性脉络膜视网膜病变患者的视网膜中心敏感性[21]，并可能使肝硬化轻微肝性脑病患者获益[22]。此外，研究还发现Hp感染可能增加结直肠肿瘤[23]、胰腺癌[24]、肺癌[25]等肿瘤的发生风险。寻找Hp感染诊断标记物对上述疾病的预防和诊治具有重要临床意义。目前临床上常用的Hp感染检测方法有13C-UBT或14C-UBT、血清Hp IgG、HpSA检测等，但尚无相关体液检测方法。

尿液可通过非侵入性途径大量获得，用于分析和评估具有可重复性，是一种理想的生物学标记物分析介质，且因能从同一个体重复采样而有利于纵向研究；此外，尿液中的蛋白和多肽高度可溶且性状稳定，在采集后数小时内不会发生明显降解[26]，便于样本制备和检测。本研究通过HPLC-MS和label-free定量分析鉴定出11个相对分子质量在10 kDa 以上的Hp感染相关尿液蛋白，这些蛋白在Hp感染者尿液中的含量显著增加，后续通过免疫学方法确定相关阈值后，有望成为Hp感染尿液诊断的生物学标记物。进一步对这些尿液蛋白进行生物信息学分析，结果显示生物素酶(P43251)可能影响机体营养状态和体质量；凝聚素(P10909)可调节ATP酶活性，并能与蛋白结合，参与动脉粥样硬化信号、网格蛋白介导的胞吞作用信号、FXR/RXR激活、LXR/RXR激活等信号通路，与阿尔茨海默病、结肠癌、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、动脉硬化、肝癌、糖尿病、心血管疾病等相关；凝溶胶蛋白(P06396)可与肌动蛋白、钙离子、肌球蛋白以及蛋白结构域结合，参与肌动蛋白细胞骨架信号、生殖细胞睾丸支持细胞连接信号、破骨细胞RANK信号以及成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞在类风湿关节炎中的作用等信号通路，与类风湿关节炎、皮肤病、结肠癌等相关；α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶(P54802)与体质量减轻、糖尿病、肝纤维化、类风湿关节炎等相关；内皮蛋白C受体(Q9UNN8)能与蛋白C末端结合并具有受体活性，参与介导血小板减少症、血栓性疾病、心肌梗死等的发生。对上述Hp感染相关尿液差异表达蛋白分子功能、相关信号通路以及与疾病相关性的分析，从另一个角度印证了既往文献报道的Hp感染与胃肠外疾病的相关性。

表1　Label-free定量分析差异表达蛋白及其验证结果

a：验证匹配实际数目；b：验证匹配理论数目；*差异表达蛋白；▲本实验使用超滤管截留10 kDa以上的蛋白，属于物理意义上的截留，此蛋白可能是以多聚体形式存在而被截留；#阳性样本表达量为0

表2　11个尿液差异表达蛋白生物信息学分析

PGLS：6-磷酸葡糖酸内酯酶；PROCR：内皮蛋白C受体；GSN：凝溶胶蛋白；CADM4：细胞黏附分子4；NAGLU：α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶；CLU：凝聚素；BTD：生物素酶；PGLYRP1：肽聚糖识别蛋白1；VGF：神经分泌蛋白VGF；XYLT1：木糖基转移酶1；DCHS1：原钙黏蛋白16

图111个尿液差异表达蛋白的相互作用网络

综上所述，本研究通过对Hp感染和非感染志愿者尿液中相对分子质量在10 kDa以上的蛋白行HPLC-MS和label-free定量分析，鉴定出11个差异表达蛋白，这些尿液蛋白有望成为诊断Hp感染的生物学标记物，并可为Hp感染与心血管疾病、阿尔茨海默病、糖尿病、免疫系统疾病等胃肠外疾病的相关性研究提供分子水平的证据。

参考文献

1 Deguchi R, Takagi A, Kawata H, et al. Association between CagA+Helicobacterpyloriinfection and p53, bax and transforming growth factor-beta-RⅡ gene mutations in gastric cancer patients[J]. Int J Cancer, 2001, 91 (4): 481-485.

2 Hughes WS. An hypothesis: the dramatic decline in heart attacks in the United States is temporally related to the decline in duodenal ulcer disease andHelicobacterpyloriinfection[J]. Helicobacter, 2014, 19 (3): 239-241.

3 Radic' M. Role ofHelicobacterpyloriinfection in autoimmune systemic rheumatic diseases[J]. World J Gastroenterol, 2014, 20 (36): 12839-12846.

4 Hsieh MC, Wang SS, Hsieh YT, et al.Helicobacterpyloriinfection associated with high HbA1c and type 2 diabetes[J]. Eur J Clin Invest, 2013, 43 (9): 949-956.

5 Khedmat H, Taheri S. Current knowledge onhelicobacterpyloriinfection in end stage renal disease patients[J]. Saudi J Kidney Dis Transpl, 2009, 20 (6): 969-974.

6 Huang WS, Yang TY, Shen WC, et al. Association betweenHelicobacterpyloriinfection and dementia[J]. J Clin Neurosci, 2014, 21 (8): 1355-1358.

7 Queiroz DM, Harris PR, Sanderson IR, et al. Iron status andHelicobacterpyloriinfection in symptomatic children: an international multi-centered study[J]. PLoS One, 2013, 8 (7): e68833.

8 Sakr SA, Badrah GA, Sheir RA. Histological and histochemical alterations in liver of chronic hepatitis C patients withHelicobacterpyloriinfection[J]. Biomed Pharmacother, 2013, 67 (5): 367-374.

9 Kutlubay Z, Zara T, Engin B, et al.Helicobacterpyloriinfection and skin disorders[J]. Hong Kong Med J, 2014, 20 (4): 317-324.

10Mischak H, Kaiser T, Walden M, et al. Proteomic analysis for the assessment of diabetic renal damage in humans[J]. Clin Sci (Lond), 2004, 107 (5): 485-495.

11Fliser D, Novak J, Thongboonkerd V, et al. Advances in urinary proteome analysis and biomarker discovery[J]. J Am Soc Nephrol, 2007, 18 (4): 1057-1071.

12Ward DG, Nyangoma S, Joy H, et al. Proteomic profiling of urine for the detection of colon cancer[J]. Proteome Sci, 2008, 6: 19.

13Xiao D, Meng FL, He LH, et al. Analysis of the urinary peptidome associated withHelicobacterpyloriinfection[J]. World J Gastroenterol, 2011, 17 (5): 618-624.

14Nakagawa H, Tamura T, Mitsuda Y, et al. Significant association between serum interleukin-6 andHelicobacterpyloriantibody levels amongH.pylori-positive Japanese adults[J]. Mediators Inflamm, 2013: 142358.

15Hershko C, Camaschella C. How I treat unexplained refractory iron deficiency anemia[J]. Blood, 2014, 123 (3): 326-333.

16Shi WJ, Liu W, Zhou XY, et al. Associations ofHelicobacterpyloriinfection and cytotoxin-associated gene A status with autoimmune thyroid diseases: a meta-analysis[J]. Thyroid, 2013, 23 (10): 1294-1300.

17Siva R, Birring SS, Berry M, et al. Peptic ulceration,Helicobacterpyloriseropositivity and chronic obstructive pulmonary disease[J]. Respirology, 2013, 18 (4): 728-731.

18Moretti E, Collodel G, Mazzi L, et al. CagA-positiveHelicobacterpyloriinfection and reduced sperm motility, vitality, and normal morphology[J]. Dis Markers, 2013, 35 (4): 229-234.

19Jafarzadeh A, Nemati M, Rezayati MT, et al. Higher serum levels of rheumatoid factor and anti-nuclear antibodies inhelicobacterpylori-infected peptic ulcer patients[J]. Oman Med J, 2013, 28 (4): 264-269.

20Payandeh M, Raeisi D, Sohrabi N, et al. Poor platelet Count Response toHelicobacterPyloriEradication in Patients with Severe Idiopathic Thrombocytopenic Purpura[J]. Int J Hematol Oncol Stem Cell Res, 2013, 7 (3): 9-14.

21Dang Y, Mu Y, Zhao M, et al. The effect of eradicatingHelicobacterpylorion idiopathic central serous chorio-retinopathy patients[J]. Ther Clin Risk Manag, 2013, 9: 355-360.

22Schulz C, Schütte K, Malfertheiner P. DoesH.pylorieradication therapy benefit patients with hepatic encephalopathy?: systematic review[J]. J Clin Gastroenterol, 2014, 48 (6): 491-499.

23Nam KW, Baeg MK, Kwon JH, et al.Helicobacterpyloriseropositivity is positively associated with colorectal neoplasms[J]. Korean J Gastroenterol, 2013, 61 (5): 259-264.

24Risch HA, Lu L, Kidd MS, et al.Helicobacterpyloriseropositivities and risk of pancreatic carcinoma[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2014, 23 (1): 172-178.

25Deng B, Li Y, Zhang Y, et al.Helicobacterpyloriinfection and lung cancer: a review of an emerging hypothesis[J]. Carcinogenesis, 2013, 34 (6): 1189-1195.

26Pieper R, Gatlin CL, McGrath AM, et al. Characterization of the human urinary proteome: a method for high-resolution display of urinary proteins on two-dimensional electrophoresis gels with a yield of nearly 1400 distinct protein spots[J]. Proteomics, 2004, 4 (4): 1159-1174.

(2015-09-09收稿；2015-09-17修回)

*基金项目：传染病预防控制国家重点实验室自主项目(2014SKLID102)；中国疾病预防控制中心传染病预防控制所科研课题

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2016.03.003

#Email: zhanghuifang@icdc.cn

&本文通信作者，Email: xiaodi@icdc.cn