LncRNA-PVT1对人胰腺癌细胞株HPAF-Ⅱ增殖和凋亡的影响*



·论著·

LncRNA-PVT1对人胰腺癌细胞株HPAF-Ⅱ增殖和凋亡的影响*

彭娟菲#黄凤婷庄燕妍陈文颖张世能&

中山大学孙逸仙纪念医院消化内科(510120)

#Email: pengjfei0305@163.com

&本文通信作者，Email: shinengz@163.net

背景：近年来，长非编码RNA(lncRNAs)在肿瘤发生、发展中的作用日益受到重视。研究发现lncRNA-PVT1在多种人类恶性肿瘤中表达上调并发挥促癌作用。目的：探讨PVT1在人胰腺癌细胞中的表达及其对HPAF-Ⅱ细胞增殖和凋亡的影响。方法：以脂质体转染技术将siRNA-PVT1转染入HPAF-Ⅱ细胞；以real-time PCR检测PVT1 mRNA表达，MTS实验和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力，流式细胞分析检测细胞周期和细胞凋亡，蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白和原癌基因蛋白c-Myc表达。结果：以人永生化正常胰腺导管上皮细胞株H6c7作为对照，各人胰腺癌细胞株中以HPAF-Ⅱ细胞PVT1 mRNA表达升高最为明显。与转染阴性对照siRNA和未予转染siRNA的细胞相比，转染siRNA-PVT1的HPAF-Ⅱ细胞PVT1 mRNA表达显著降低，细胞增殖能力减弱，发生细胞周期G1期阻滞并出现凋亡峰，细胞中凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3、cleaved-PARP表达上调，Bcl-2/Bax比值降低，c-Myc蛋白表达下调。结论：LncRNA-PVT1在人胰腺癌细胞株HPAF-Ⅱ中呈高表达，其可能通过调控c-Myc表达影响HPAF-Ⅱ细胞的增殖和凋亡。

关键词胰腺肿瘤；长非编码RNA；PVT1；原癌基因蛋白质c-myc；细胞增殖；细胞凋亡

Effect of LncRNA-PVT1 on Proliferation and Apoptosis of Human Pancreatic Cancer Cell Line HPAF-Ⅱ

PENGJuanfei,HUANGFengting,ZHUANGYanyan,CHENWenying,ZHANGShineng.

DepartmentofGastroenterology,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou(510120)

Correspondence to: ZHANG Shineng, Email: shinengz@163.net

Background: Recent studies have shown that long non-coding RNAs (lncRNAs) play important roles in carcinogenesis and cancer biology and the related context has attracted more and more attentions. PVT1, which encodes a lncRNA, is reported to be up-regulated and exhibit pro-oncogenic activity in a wide variety of human cancers. Aims: To investigate the expression of PVT1 in human pancreatic cancer cells and its effect on proliferation and apoptosis of HPAF-Ⅱ cells. Methods: One target siRNA against PVT1 was synthesized and transfected into HPAF-Ⅱ cells by using lipofactamine technique. PVT1 mRNA expression was detected by real-time PCR; capability of cell proliferation was examined by MTS and colony formation assays; cell cycle progression and apoptosis were measured by flow cytometry; and Western blotting was performed to determine the expressions of apoptosis-related proteins and proto-oncogene protein c-Myc. Results: The mRNA expression of PVT1 in several human pancreatic cancer cell lines, especially HPAF-Ⅱ cells was significantly higher than that in H6c7, a human immortalization normal pancreatic ductal epithelial cell line. Compared with HPAF-Ⅱ cells transfected with negative control siRNA or without transfection, silencing of PVT1 by siRNA-PVT1 resulted in remarkable reduction in cell proliferation, cell cycle G1 phase arrest, and notable apoptosis; meanwhile, the expressions of apoptosis-related proteins (cleaved-caspase-3 and cleaved-PARP) were up-regulated, the ratio for Bcl-2/Bax was decreased, and the expression of c-Myc protein was down-regulated. Conclusions: LncRNA-PVT1 is highly expressed in human pancreatic cancer cell line HPAF-Ⅱ. It may affect the proliferation and apoptosis of HPAF-Ⅱ cells partially through regulating c-Myc expression.

Key wordsPancreatic Neoplasms;Long Non-Coding RNA;PVT1;Proto-Oncogene Proteins c-myc;

Cell Proliferation;Apoptosis

胰腺癌早期诊断率低，根治性手术率低，预后极差，死亡率高[1]，探讨胰腺癌的发生、发展机制有利于提高其临床诊治水平。近年来，长非编码RNA(long non-coding RNAs, lncRNAs)在肿瘤发生、发展中的作用日益受到重视。LncRNAs是一类转录本长度超过200 nt 的RNA分子，不编码蛋白质，但可通过表观遗传学以及转录和转录后调控层面调控基因表达[2]。LncRNA-PVT1(plasmacytoma variant translocation 1)基因定位于染色体8q24[3]，研究发现其参与了Burkitt淋巴瘤[4]、多发性骨髓瘤[5]、卵巢癌和乳腺癌[6]、结直肠癌[7]等多种恶性肿瘤的发生、发展，并与预后不良相关。已知PVT1能调节人胰腺癌细胞对吉西他滨的化疗敏感性[8]，但PVT1在胰腺癌细胞中的表达情况及其与胰腺癌细胞生物学特性的关系则尚未见相关文献报道。本研究检测了PVT1在人胰腺癌细胞中的表达情况，并初步探讨其对HPAF-Ⅱ细胞增殖和凋亡的影响，以期为进一步明确PVT1在胰腺癌发生、发展中的作用奠定基础。

材料与方法

一、细胞株和主要试剂

人胰腺癌细胞株PANC-1、SW1990、MIAPaca-2、BXPC-3、DAN-G、HPAF-Ⅱ购自ATCC公司；人永生化正常胰腺导管上皮细胞株H6c7由加拿大安大略癌症研究所Ming-Sound Tsao教授惠赠，体外培养传代。RPMI 1640培养基、K-SFM无血清培养基、Opti-MEM®减血清培养基、胎牛血清(FBS)、重组表皮生长因子(rEGF)、牛垂体提取物(BPE)、牛血清白蛋白(BSA)、Lipofectamine®RNAiMAX转染试剂、RIPA细胞裂解液(Thermo Fisher Scientific Inc.)；siRNA-PVT1(si-PVT1)、siRNA-Negative Control(si-NC)、siRNA-Negative Control-FAM(si-NC-FAM)由苏州吉玛基因药物科技有限公司设计、合成(表1)；RNAiso Plus总RNA提取试剂、PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)、SYBR®Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa Bio Inc.)；MTS试剂(Promega Corporation)；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(Bender)；细胞周期检测试剂盒(碧云天生物技术)；caspase-3、PARP、Bcl-2、Bax、GAPDH抗体和相应二抗(Cell Signaling Technology, Inc.)；c-Myc抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)；PVDF膜、ImmobilonTMWestern Chemiluminescent ECL超敏发光液(Merck Millipore Corporation)；细胞培养耗材(Corning Incorporated)。

表1　siRNAs序列

二、方法

1. 细胞培养：HPAF-Ⅱ细胞置于含10% FBS的RPMI 1640培养基(含100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素)中，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养，每2～3 d换液或传代1次，0.02% EDTA和0.25%胰蛋白酶1∶1混合消化，完全培养基中和。H6c7细胞置于K-SFM无血清培养基(含100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、0.2 μg/L rEGF和 20 mg/L BPE)，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养，0.05%胰蛋白酶消化，0.4% BSA中和。

2. 实验分组和瞬时转染：实验设4个组别：si-PVT1组、si-NC组和si-NC-FAM组分别以Lipo-fectamine®RNAiMAX转染试剂将si-PVT1、si-NC和si-NC-FAM(终浓度120 nmol/L)转染入HPAF-Ⅱ细胞，si-Blank Cell组(si-BC组)HPAF-Ⅱ细胞常规培养，不予转染siRNA。转染方法：HPAF-Ⅱ细胞以2.5×105/孔常规培养于6孔板，待融合度达60%～70%时，将培养基换成Opti-MEM®减血清培养基，严格按试剂说明书操作进行转染。

3. Real-time PCR：以RNAiso Plus试剂提取各人胰腺癌细胞株总RNA，琼脂糖凝胶电泳法检测RNA完整性，以PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)逆转录合成cDNA，操作均严格按试剂说明书进行。采用NCBI/Primer-BLAST软件设计PCR引物，由上海TaKaRa公司合成：β-actin(内参)上游5’-GTT GCG TTA CAC CCT TTC TTG AC-3’，下游5’-CTC GGC CAC ATT GTG AAC TTT G-3’；PVT1上游5’-TTG GCA CAT ACA GCC ATC AT-3’，下游5’-GCA GTA AAA GGG GAA CAC CA-3’。PCR扩增采用SYBR®Green Ⅰ方法，2-ΔΔCt法计算PVT1 mRNA相对表达量。实验独立重复3次，每次每一样本设3个复孔。

4. MTS实验：各组HPAF-Ⅱ 细胞以4×103/孔(100 μL)接种于96孔板，待融合度达50%～70%时进行转染；分别于转染后24 h、48 h、72 h、96 h加入10 μL MTS，37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养3.5 h，于酶联免疫检测仪波长492 nm处测定吸光度(A)值，以未接种细胞、仅加入培养基和MTS的空白孔调零。实验独立重复3次，每组设5个复孔。

5. 平板克隆形成实验：各组HPAF-Ⅱ细胞转染后 72 h，以4×103/孔接种于6孔板，常规培养9 d后，弃培养基，PBS洗2次，4%多聚甲醛溶液固定15 min，0.1%结晶紫染色20 min，以PBS洗去残余染料，待自然干燥后拍照。实验独立重复3次。

6. 流式细胞分析：各组HPAF-Ⅱ细胞转染后72 h，以PBS重悬为(1～5)×109/L的细胞悬液，取0.5 mL 立即用于细胞凋亡检测，0.5 mL用于细胞周期检测，操作均严格按试剂盒说明书进行。实验独立重复3次。

7. 蛋白质印迹法：各组HPAF-Ⅱ细胞转染后72 h，RIPA细胞裂解液裂解、提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。每组取总蛋白50 μg上样，恒压浓缩胶60 V、分离胶100 V电泳约90 min，4 ℃ 200 mA 转膜120 min，漂洗转印后的PVDF膜，室温3次×10 min，5% BSA室温封闭1.5 h，加入一抗4 ℃ 孵育过夜，1×TBST洗膜3次×10 min，加入二抗室温孵育2 h，1×TBST洗膜3次×10 min，ECL发光液显色。实验独立重复3次。

三、统计学分析

结果

一、PVT1在人胰腺癌细胞中的表达

以人永生化正常胰腺导管上皮细胞株H6c7作为对照，real-time PCR检测显示人胰腺癌细胞株PANC-1、SW1990、BXPC-3、DAN-G、HPAF-Ⅱ中的PVT1 mRNA表达明显升高，以HPAF-Ⅱ细胞升高最为显著(P<0.01)，人胰腺癌细胞株MIAPaca-2中的PVT1 mRNA表达则明显降低(图1A)，故选择HPAF-Ⅱ细胞为研究对象进行后续实验。

二、siRNA转染效率

si-PVT1、si-NC以及与两者相同大小的si-NC-FAM转染入HPAF-Ⅱ细胞后，荧光显微镜观察显示，si-NC-FAM组带绿色荧光的HPAF-Ⅱ细胞(图1C)占细胞总数(图1B)的百分率>90%；real-time PCR检测显示，si-PVT1组HPAF-Ⅱ细胞中的PVT1 mRNA表达显著低于si-NC组和si-BC组(P<0.05)，si-NC与si-BC两组间差异则无统计学意义(P>0.05)(图1D)。

三、抑制PVT1对HPAF-Ⅱ细胞增殖和凋亡的影响

MTS实验显示，转染后48 h起，si-PVT1组HPAF-Ⅱ细胞A值开始显著低于si-NC组和si-BC组(P<0.01)(图2A)；平板克隆形成实验显示，转染后72 h，si-PVT1组细胞形成的克隆数显著低于si-NC组和si-BC组(P<0.01)，si-NC与si-BC两组间差异则无统计学意义(P>0.05)(图2B)。

图1　人胰腺癌细胞PVT1表达(A)以及siRNA转染效率(B、C、D)

流式细胞分析显示，转染后72 h，si-PVT1组HPAF-Ⅱ细胞出现凋亡峰，凋亡率显著高于si-NC组和si-BC组(P<0.05)(图2C)；蛋白质印迹法检测进一步证实，与si-NC组相比，si-PVT1组凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3(P=0.000 8)、cleaved-PARP(P=0.000 4)表达显著上调，Bcl-2/Bax比值降低(P=0.049 5)(图2D)。

上述发现提示抑制PVT1可抑制HPAF-Ⅱ细胞增殖，诱导细胞凋亡。

四、抑制PVT1对HPAF-Ⅱ 细胞细胞周期的影响

流式细胞分析显示，转染72 h后，si-PVT1组G1期细胞比率较si-NC组和si-BC组显著增高(P<0.01)，G2期细胞比率显著降低(P<0.01)，各组间S期细胞比率无明显差异(P>0.05)(图2E、表2)，结合MTS实验结果，推测抑制PVT1可引起HPAF-Ⅱ细胞细胞周期G1期至G2期转换阻滞。

五、PVT1调控HPAF-Ⅱ细胞中的c-Myc表达

蛋白质印迹法检测显示，转染72 h后，si-PVT1组HPAF-Ⅱ 细胞中的c-Myc表达较si-NC组显著降低(P=0.012 3)，si-NC与si-BC两组间差异则无统计学意义(P=0.803 2)(图3)，提示PVT1对c-Myc表达具有调控作用，抑制PVT1可下调c-Myc表达。

图2　抑制PVT1对HPAF-Ⅱ细胞增殖(A、B)、凋亡(C、D)和细胞周期(E)的影响

图3　抑制PVT1对HPAF-Ⅱ细胞中c-Myc表达的影响

组别G1期G2期S期si-BC29.51±1.5636.19±1.4434.30±0.64si-NC27.11±1.4037.16±1.3735.73±1.53si-PVT153.05±3.17**9.98±0.60**36.97±3.53

**与si-NC组比较，P<0.01

讨论

既往诸多研究发现胰腺癌组织和细胞中存在lncRNAs表达异常，如高表达的HOTAIR[9]、H19[10]、HOTTIP[11]、MALAT-1[12]、HULC[13]、AF339813[14]和低表达的gas5[15]、ENST00000480739[16]，这些异常表达的lncRNAs可通过特定机制调节胰腺癌细胞的分化、增殖、凋亡、迁移、侵袭等生物学行为，从而影响胰腺癌的发生、发展进程，如H19可通过拮抗miRNA let-7增强其靶mRNA HMGA2介导的上皮-间质转换(EMT)，从而促进胰腺导管腺癌细胞侵袭和迁移[10]，而HOTTIP可通过调节多个HOX基因家族成员表达而影响胰腺癌细胞的增殖、凋亡和迁移[11]。近年研究发现lncRNA-PVT1在多种人类恶性肿瘤中表达上调并发挥促癌作用。You等[8]的研究显示，使人胰腺癌细胞株ASPC-1中的PVT1功能失活可增强细胞对吉西他滨的化疗敏感性。Huang等[17]发现，与癌旁非癌组织相比，PVT1在胰腺导管腺癌组织中呈显著高表达，并与肿瘤临床分期和预后不良相关。但PVT1在人胰腺癌细胞中的表达情况及其可能作用机制尚未见相关文献报道。

本研究采用real-time PCR技术检测了PVT1在人永生化正常胰腺导管上皮细胞株H6c7和多种人胰腺癌细胞株中的表达情况，结果显示与H6c7细胞相比，PVT1在人胰腺癌细胞株HPAF-Ⅱ、DAN-G、SW1990、BXPC-3、PANC-1中呈高表达，在人胰腺癌细胞株MIAPaca-2中则呈低表达，以HPAF-Ⅱ细胞表达升高最为明显。以脂质体转染技术将siRNA-PVT1转染入HPAF-Ⅱ细胞后，其PVT1 mRNA表达显著降低，发生细胞周期G1期阻滞，细胞增殖明显受到抑制并出现凋亡峰，凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3、cleaved-PARP表达上调，Bcl-2/Bax比值降低，提示沉默PVT1表达可抑制HPAF-Ⅱ细胞增殖，诱导细胞凋亡。

PVT1基因与原癌基因Myc共同定位于染色体8q24，位于Myc基因下游50 kb，并延伸入Myc末端着丝粒200 kb，两者在肿瘤细胞中常共同扩增[18]。PVT1基因启动子区近转录起始点区域(-155/-95)存在Myc结合位点(E-box CACGCG)，Myc可与此位点结合而调节PVT1转录，即PVT1是Myc的靶基因之一[19]。此外，研究发现PVT1亦可调节Myc蛋白表达。在Myc与PVT1共同扩增的乳腺癌细胞株中，抑制PVT1表达并不影响c-Myc mRNA水平，但可使c-Myc蛋白表达下调，并促进细胞凋亡；在Myc阳性结肠癌细胞株HCT116中敲除PVT1基因可致Myc蛋白表达下调，细胞增殖能力减弱，在小鼠中形成肿瘤的能力消失[3]。本研究发现以siRNA沉默HPAF-Ⅱ细胞中的PVT1表达可显著降低c-Myc蛋白表达，提示PVT1可能系通过调节c-Myc表达在胰腺癌细胞中发挥作用。

综上所述，lncRNA-PVT1在人胰腺癌细胞株HPAF-Ⅱ中呈高表达，可促进HPAF-Ⅱ细胞增殖，调节细胞周期分布，并抑制细胞凋亡，上述作用可能是通过调控c-Myc表达实现的。后续拟进一步开展体内实验以验证本研究结果，并着重探讨PVT1的具体作用机制。

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(2015-10-14收稿；2015-10-23修回)

*基金项目：国家自然科学基金面上项目(81572348)；广东省自然科学基金(2015A030313115)；广州市科技计划项目科学研究专项(201510010206)

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2016.03.002