不同年龄IVF-ET患者卵丘颗粒细胞端粒长度与卵母细胞成熟度及妊娠结局的关系

王兴玲，蔡鹏飞，张文娟，肖雅琳

郑州大学第三附属医院生殖医学中心 郑州 450052

△女，1962年2月生，博士，主任医师，教授，研究方向：生殖内分泌与辅助生殖，E-mail：wangxingling123456@163.com



不同年龄IVF-ET患者卵丘颗粒细胞端粒长度与卵母细胞成熟度及妊娠结局的关系

王兴玲△，蔡鹏飞，张文娟，肖雅琳

郑州大学第三附属医院生殖医学中心 郑州 450052

△女，1962年2月生，博士，主任医师，教授，研究方向：生殖内分泌与辅助生殖，E-mail：wangxingling123456@163.com

关键词体外受精-胚胎移植；卵丘颗粒细胞；端粒长度；卵母细胞成熟度

摘要目的：探讨体外受精-胚胎移植(IVF-ET)卵丘颗粒细胞的端粒长度与卵母细胞成熟度及妊娠结局的关系。方法：收集81例行体外受精-胚胎移植患者的卵丘颗粒细胞,根据患者的年龄，分为低龄(<35岁)组42例和高龄(≥35岁)组39例。应用qRT-PCR测量卵丘颗粒细胞端粒长度。结果：卵丘颗粒细胞端粒长度与年龄呈负相关(r=-0.267，P=0.021)，低、高龄组内成熟卵母细胞的卵丘颗粒细胞端粒长度明显比未成熟卵母细胞的长(P<0.05)。高龄组妊娠者端粒长度较未妊娠者长(P<0.05)。结论：在IVF-ET中，卵丘颗粒细胞的相对端粒长度随年龄增长逐渐缩短，可反映卵母细胞的成熟度;端粒长度缩短可能会影响妊娠结局。

Relationship of telomere length in cumulus cells with oocytes maturation and outcome of IVF-ET in patients with different ages

WANGXingling,CAIPengfei,ZHANGWenjuan,XIAOYalin

ReproductiveCenter,theThirdAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsIVF-ET;cumulus cell;telomere length;oocyte maturation

AbstractAim: To investigate the relationship of the relative telomere length in cumulus cells(CCs) with oocytes at different mature stages and the outcome of in vitro fertilization and embryo transfer(IVF-ET). Methods: Oocyte-cumulus complex samples were collected from 81 patients undergoing IVF-ET and CCs were manually separated. A total of 42 women(<35 years,the younger group) and 39 women(≥35 years, the older group) were collected. The oocyte maturation and the result of clinical pregnancy were recorded in different groups. DNA was extracted from CCs and assessed for telomere length by real-time quantitative PCR. Results: There were negative correlation between relative telomere length of CCs with the patients′ age (r=-0.267,P=0.021). The relative telomere length of CCs was higher in mature oocytes than immature oocytes in both groups(P<0.05). There was a significantly higher telomere length of CCs in the pregnant subgroup than in the non-pregnant subgroup among the older group(P<0.05). Conclusion: In IVF-ET, the relative telomere length of CCs gradually shortened with age. The telomere length of CCs could reflect the degree of oocyte maturation and may be associated with pregnancy outcome in IVF-ET.

胚胎质量是决定体外受精-胚胎移植(IVF-ET)成功的关键因素，成熟优质的卵母细胞是形成高质量胚胎的先决条件。直接对卵母细胞和胚胎进行生物学检测来评估二者质量，存在巨大风险和伦理限制。目前临床上主要应用形态学方法筛选卵母细胞和胚胎，由于形态学评估方法受到操作者主观因素的影响，因而存在局限性。卵泡内颗粒细胞与卵母细胞及胚胎关系密切，卵丘颗粒细胞和卵母细胞形成卵丘-卵母细胞复合体，细胞间存在广泛的缝隙连接。通过缝隙连接，细胞间相互交换物质、相互促进、共同发育[1]。颗粒细胞的增殖能力影响卵母细胞发育潜能，颗粒细胞的凋亡程度影响卵母细胞成熟度、胚胎质量[2]。细胞的凋亡受端粒和端粒酶调控，端粒是染色体末端的帽状结构主要维持基因组的完整性和稳定性[3]。随细胞分裂，端粒不断缩短，当端粒缩短至其阈值时细胞凋亡。研究卵母细胞周围的颗粒细胞端粒,将为成熟卵母细胞、优质胚胎选择提供客观、准确且无创的方法,从而提高妊娠率；同时为今后深入研究颗粒细胞端粒在未成熟卵体外培养(IVM)中的作用提供实验基础。目前国内外关于IVF-ET中颗粒细胞端粒与卵母细胞及妊娠结局的相关研究较少。作者通过测定IVF-ET患者卵丘颗粒细胞端粒的相对长度，研究不同年龄组内端粒与卵母细胞成熟及妊娠结局的关系，旨在为卵母细胞及胚胎评估提供新的方法。

1对象与方法

1.1研究对象收集 2014年1月至2014年12月在郑州大学第三附属医院因输卵管因素接受IVF-ET治疗的81例患者, 依据患者年龄分为低龄组(<35岁)42例和高龄组(≥35岁)39例。根据卵母细胞成熟度分为成熟卵泡颗粒细胞和未成熟卵泡颗粒细胞；移植胚胎后根据阴道B超是否见到孕囊将患者分为妊娠和非妊娠者。纳入标准:①符合输卵管性不孕的诊断。②男方精液正常。 ③既往月经规律。④近3个月内未服用激素类药物。排除标准:①排卵障碍性疾病(多囊卵巢综合征、高泌乳素血症等)。②子宫内膜异常(子宫内膜异位症、黏膜下子宫肌瘤等)。③有卵巢手术史。该研究获得郑州大学第三附属医院伦理委员会批准，患者均知情同意并签署同意书。

1.2促排卵方案采用黄体期短效长方案促排卵治疗，在黄体中期开始注射短效达菲林进行降调节。降调达标后开始每日注射促性腺激素(gonadotropin,Gn)，启动剂量为150～300 IU/d；根据患者卵泡发育情况适时调整药物剂量,当达到至少有3个优势卵泡发育至直径为18～20 mm,肌内注射重组人绒毛膜促性腺激素(rhCG,默克雪兰诺公司)250 mg，34～36 h后B超引导下经阴道穿刺取卵。取卵后第3天，根据胚胎形态学参数，移植Ⅰ～Ⅱ级胚胎。低龄组患者移植2枚胚胎，高龄组患者移植3枚胚胎。移植后所有患者均给予黄体酮60 mg肌内注射及地屈孕酮片(达芙通,苏威制药)20 mg口服。移植后14 d检测血hCG水平，确定生化妊娠者(>5 IU/L)，于移植后第35天经阴道B超见孕囊者确定为临床妊娠。

1.3标本的采集与保存经阴道超声引导下穿刺取卵，采用机械法剥除单个卵母细胞周围的部分卵丘颗粒细胞。将相同成熟度卵母细胞的颗粒细胞混合，在PBS缓冲液中冲洗3次后，将剥离下来的卵丘颗粒细胞收集在微量离心管中。收集颗粒细胞的离心管，置于-80 ℃冷冻保存，实验备用。患者均采集成熟及未成熟卵母细胞和颗粒细胞。依据卵母细胞成熟度不同，将对应的卵丘颗粒细胞分为：成熟卵母细胞的颗粒细胞(CC-MⅡ)、未成熟卵母细胞的颗粒细胞(CC-MⅠ)。卵母细胞成熟度分级:①MⅡ期形态表现为卵丘松散，可见透明带和第一极体，放射冠呈放射状排列。②MⅠ期表现为卵丘紧密，透明带不清楚，第一极体尚未排出，放射冠不同程度分散。

1.4提取颗粒细胞的DNA和检测端粒长度

1.4.1DNA提取从微量离心管中取100 μL卵丘颗粒细胞到1.5 mL的EP管中，加入20 μL蛋白酶K、180 μL GA，混匀后56 ℃水浴30 min；加入200 μL的GB，混匀后70 ℃水浴10 min;加入200 μL的乙醇。混匀后将溶液全部转入吸附柱CR2中，13 400 r/min离心30 s;向CR2中加入500 μL的GD，13 400 r/min离心30 s；向CR2中加入600 μL的PW，13 400 r/min离心30 s,重复1次；将CR2转入一个干净EP管中，滴加40 μL的TB，13 400 r/min离心2 min，收集EP管中溶液，-20 ℃保存颗粒细胞DNA。

1.4.2紫外分光光度计测定DNA的纯度及浓度取DNA溶液1 μL分别测260、280 nm波长下的光密度(OD)值,然后计算OD260 nm/OD280 nm的比值。OD260 nm/OD280 nm为1.8～2.0，DNA样品浓度为(72.0±8.6) μg/L。

1.4.3引物的设计、合成与端粒长度检测引物设计参照文献[1],由上海生工生物工程有限公司合成，PCR反应引物序列见表1。Real-time PCR 由北京康为世纪公司提供试剂盒，PCR仪为ABI7500。反应体系:上下游引物1 μL、UltraSYBR Mixture 10 μL、模板DNA 2 μL、ddH2O 6 μL，反应体系 20 μL。反应条件:95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火和延伸1 min,扩增40个循环。每次qRT-PCR反应均重复3次，端粒相对长度参照Cawthon[4]的方法进行分析。

表1　引物序列

1.5统计学处理采用Excel 2007进行数据录入，SPSS 19.0进行分析，定量资料两组间比较采用两独立样本t检验；成熟卵泡颗粒细胞端粒长度与年龄的关系采用Pearson直线相关分析。检验水准α=0.05。

2结果

2.1一般情况低龄组妊娠25例、未妊娠17例，高龄组妊娠21例、未妊娠18例。 两组患者年龄、不孕时间及基础内分泌等基本情况见表2。

表2　低龄组和高龄组患者一般情况比较

2.2CC-MⅡ端粒长度与年龄的关系低龄组CC-MⅡ端粒长度与高龄组比较差异有统计学意义[(4.25±0.93)vs(3.82±0.84)，t=2.514,P=0.030]。随患者年龄的增加，CC-MⅡ端粒长度逐渐降低，即颗粒细胞的端粒与年龄呈负相关(r=-0.267，P=0.021)。

2.3颗粒细胞端粒长度与卵泡成熟的关系 低龄组内CC-MⅡ的端粒长度大于CC-MⅠ[(4.25±0.93)vs(3.50±0.84)，t=3.968,P<0.001]；高龄组内CC-MⅡ的端粒长度大于CC-MⅠ[(3.82±0.84)vs(3.33±0.79)，t=2.652,P=0.011]。

2.4不同妊娠结局对应的颗粒细胞端粒长度比较低龄组中妊娠者端粒长度与未妊娠者比较[(4.45±0.98)vs(3.95±0.78)]，差异无统计学意义(t=1.789,P=0.081)；高龄组中妊娠者端粒较未妊娠者长[(4.13±0.75)vs(3.47±0.81)，t=2.635,P=0.012]。

3讨论

端粒是染色体末端的一种特殊帽状结构，由重复串联的TTAGGG序列和酶构成。端粒维持染色体结构基因的完整性和细胞的增殖能力。研究[5]发现端粒与生殖能力密切相关，卵巢储备下降的妇女其端粒较储备正常的妇女明显缩短。然而，端粒受较多因素如端粒酶活性、年龄、环境因素等的影响。通过培育敲除端粒酶的小鼠发现，随繁殖代数增加、端粒不断缩短，小鼠逐渐出现获卵数少、受精率低、较少的优质胚胎及不孕等不良结局[6]。有学者[7]研究卵泡闭锁与端粒酶之间关系发现，大鼠颗粒细胞中端粒酶在卵泡发育、成熟中起重要作用；因为端粒酶活性降低致端粒缩短可能与卵泡闭锁有关。女性的卵巢功能和卵母细胞质量受年龄影响，有学者[8]认为这可能是年龄增长，细胞复制次数增多、营养供应不足导致有害代谢产物活性氧基团(ROX)在胞内蓄积。ROX结合到染色体末端的端粒上，使端粒不断缩短导致结构基因受损，从而影响生殖能力。该研究结果发现成熟卵泡内颗粒细胞端粒长度与年龄呈负相关。

卵泡发育、成熟受人类基因组调控，是一个高度复杂、有序的过程，在此过程中卵母细胞和颗粒细胞相互作用、同步发育[9]。颗粒细胞中特定的基因与卵母细胞减数分裂和胞核成熟密切相关[10]，颗粒细胞的端粒因端粒酶缺乏不断缩短，影响颗粒细胞功能，最终阻碍卵母细胞成熟。该研究结果显示CC-MⅡ端粒较未成熟的长，这与以往研究[11-12]结果一致。这可能是在细胞分裂过程中氧化应激反应产生了大量的氧自由基，氧自由基对重复序列TTAGGG中鸟嘌呤特别敏感[13]。通过过氧化作用使其中的氨基和亚氨基被氧化加速端粒隐缩，从而导致功能基因受损、染色体断裂，颗粒细胞衰老、凋亡。颗粒细胞内大量的凋亡信号经缝隙连接进入卵母细胞，影响卵母细胞质量。Cheng等[11]认为拥有较长端粒的颗粒细胞可为卵泡的发育提供适宜的微环境，有利于形成优质成熟的卵母细胞和高质量胚胎。

颗粒细胞凋亡率和卵泡的发育及胚胎移植后妊娠结局密切相关[2]。作者对不同年龄段患者妊娠和未妊娠者颗粒细胞端粒进行比较，发现高龄组妊娠者颗粒细胞端粒较长，但低龄组妊娠和未妊娠患者中无此差异。Biron-Shental等[14]研究发现在适龄妇女中，未妊娠妇女端粒较妊娠的明显缩短；他认为端粒缩短对胎盘功能有不利影响，导致胚胎宫内生长受限及不良的妊娠结局。该研究未发现低龄组妊娠、未妊娠者端粒长度差异，可能是收集样本量较小的原因。Keefe等[15]通过追踪IVF妊娠结局的研究发现，妊娠组胚胎对应的极体中的端粒较未妊娠组的更长。Cheng等[11]研究不同级别胚胎对应的颗粒细胞端粒显示：优质胚胎所对应的颗粒细胞的明显较长。Chen等[16]的研究表明颗粒细胞中端粒可以反映卵母细胞和胚胎中的端粒情况。该研究发现颗粒细胞的端粒与妊娠结局可能存在关联。这可能是调控颗粒细胞端粒缩短的信息通过某种作用机制影响卵母细胞和胚胎，从而对妊娠结局产生影响。有关颗粒细胞与胚胎质量及妊娠结局之间的具体分子机制有待进一步研究。

综上所述，在IVF过程中，卵丘颗粒细胞对卵母细胞的成熟和胚胎发育有着不可或缺的作用。颗粒细胞的凋亡程度直接影响卵泡发育和胚胎质量，端粒和端粒酶与凋亡密切相关。加深对颗粒细胞端粒的研究，延缓端粒缩短，将可能促进体外培养的卵母细胞成熟；进而改善卵母细胞和胚胎质量，提高IVF的妊娠率。

参考文献

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[3]史惠蓉,张梦真,乔玉环.卵巢上皮性肿瘤端粒酶活性定量检测[J].郑州大学学报(医学版),2002,37(1):75

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[11]CHENG EH,CHEN SU,LEE TH,et al.Evaluation of telomere length in cumulus cells as a potential biomarker of oocyte and embryo quality[J].Hum Reprod,2013,28(4):929

[13]OZTURK S,SOZEN B,DEMIR N.Telomere length and telomerase activity during oocyte maturation and early embryo development in mammalian species[J].Mol Hum Reprod,2014,20(1):15

[15]KEEFE DL,LIU Lin.Telomeres and reproductive aging[J].Reprod Fertil Dev,2009,21(1):10

[16]CHEN H,WANG W,MO Y,et al.Women with high telomerase activity in luteinised granulosa cells have a higher pregnancy rate during in vitro fertilisation treatment[J].J Assist Reprod Genet,2011,28(9):797

中图分类号R711.6

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.023