TNF-a基因结构和功能生物信息学预测1*

于欣杨震楚元奎于美玲张怡清

1.宁夏医科大学临床医学院医学检验系 宁夏银川 750004；2.宁夏医科大学临床学院心脏中心 宁夏银川 750004；3.宁夏医科大学药剂科 宁夏银川 750004

TNF-a基因结构和功能生物信息学预测1*

于欣1杨震2△楚元奎1于美玲3张怡清1

1.宁夏医科大学临床医学院医学检验系 宁夏银川 750004；2.宁夏医科大学临床学院心脏中心 宁夏银川 750004；3.宁夏医科大学药剂科 宁夏银川 750004

目的：以TNF-a为研究对象，对其蛋白结构进行生物信息学预测和分析。方法：利用生物信息学软件对基因编码的蛋白质结构、理化性质、信号肽、跨膜结构、亚细胞定位、二级结构进行生物信息学分析。结果：TNF-a为脂溶性、胞外为主的具有信号肽分泌的蛋白，有8个磷酸化位点和7个糖激化位点，二级结构以β折叠为主；结论：TNF-a是一个很重要的细胞因子，本研究对TNF-a蛋白结构与功能的初步探索，对在蛋白质水平进一步了解TNF-a基因蛋白效应，进而探索其与高血压及炎症的关系。

TNF-a，生物信息学

对于蛋白质结构和功能，尽管可以通过实验方法来实现，但利用生物信息学可以成本低且快速预测分析蛋白质结构和功能特性，尤其是对一些临床疾病参与的蛋白质的基础研究具有更大理论价值[1]。 伴随着分子遗传学在检验医学中的进步,一些临床遗传学研究从简单的单基因疾病转向于复杂的多基因疾病研究如心血管疾病，高血压，各种肿瘤，炎症[2]等的研究中，TNF-a 是具有多种生物活性的细胞因子，TNF-a是体内与内分泌、炎症关系最为密切的炎性因子［3］， 以自分泌以及旁分泌等多种形式对不同器官产生不一样的生物学效应。笔者利用生物信息学一些软件分析 TNF-a不同特点，为研究其在临床常见疾病如高血压发生与发展能提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料序列

以登陆数列号（Accession:ADV31546.2 GI:332038858）在Genbank数据库检索得到人的蛋白序列。

1.2 方法

笔者通过在线获取生物信息学软件工具 protparam 分析TNF-a蛋白的物理和化学特性；利用软件TargetP和PSORTⅡ综合分析其亚细胞定位；采用软件 SignalP4.0分析信号肽；采用TMHMM Sever对TNF-A跨膜结构进行预测；分别利用NetPhos2.0和NetOGlyc3.1对其磷酸化位点和糖基化位点进行前瞻性分析；利用生物学软件 Smart对 TNF-a在线预测其保守结构域；利用DNAStar对其在线分析二级结构及抗原系数，所有在线工具网址见文献［1］。

2 结果与分析

2.1 软件分析 采用在线软件protparam在网上对TNF-a蛋白的理化性质进行预测分析，发现TNF-a由233个氨基酸组成，分子式为 C1152H1825N313O337S6，其相对分子质量数值是25644.4，理论等电点pI是6.44；在构成TNF-a蛋白的二十种氨基酸中，Leu所占成分比例最高，占12.9%，而Met和Trp百分含量较少，占0.9%，未发现Pyl和Sec。带负电荷氨基酸残基数为23，带正电荷氨基酸残基数为22；不稳定系数为40.75，依据Guruprasad方法，分析结果提示TNF-a蛋白不稳定性；脂肪氨基酸系数是98.37，属于脂溶性蛋白；总平均亲水性为-0.047。

2.2 TNF-a蛋白信号肽分析

TNF-a分泌蛋白N端15～35位氨基酸的疏水性短肽区域，引导蛋白质的肽链通过内质网进入腔内，这段疏水短肽即为信号肽。本研究TNF-a蛋白信号肽是被在线工具SignalP4.0进行信号肽预测的，首先在线输入前七十个氨基酸，利用神经网络模型NN 和隐马尔可夫模型HMM 进行预测，随后给出Y、C、S－score计测结果，通过Y最大值来判断分析信号肽剪切位点；如何判断分泌蛋白，多利用S平均值来判断。若S平均值高于0.5，则为分泌蛋白，存在信号肽。预测（图1）表明，C结果值为0.427，Y结果值为0.586，S结果值为0.956，其剪切位点在29～30位氨基酸之间，且S平均值0.956大于0.5，说明TNF-a是具有信号肽的分泌蛋白。

图1 TNF-a蛋白信号肽分析

2.3 TNF-a蛋白跨膜结构预测

膜蛋白常有以下如胞外区、跨膜区和胞内区，跨膜区就是蛋白在细胞膜内的部分，有的蛋白有一个或多个跨膜区。笔者采用生物在线软件工具TMHMM2.0Sever对TNF-a蛋白跨膜结构进行分析，结果（图 2）表明，TNF-a蛋白或许是由跨膜区（35～5 7位氨基酸）、胞外区（蛋白的58～233位氨基酸处于细胞膜表面）以及胞内区（1～34位氨基酸）部分构成的膜蛋白。

图2 TNF-a蛋白的跨膜结构分析

2.4 TNF-a蛋白的极性预测分析

笔者采用在线软件 protscale把 TNF-a蛋白极性进行结果Zimmerman分析，结果( 图3) 显示该蛋白多肽链Arg氨基酸是最高分值52.0；Leu具有最低分值0.130。

图3 TNF-a蛋白的极性预测分析

2.5 TNF-a蛋白的亚细胞定位分析

把 TNF-a蛋白蛋白序列输入在线亚细胞定位生物信息工具TargetP（由丹麦TeKniske大学生物学序列分析中心提供）。在序列来源项选择noplant ，其他选项用默认值由返回的结果，表明该蛋白大部分（值为 0.891）集中在细胞其它位置。进一步登录日本的PSORTII Prediction，利用the k-NN Prediction分析，基本确认该TNF-a蛋白分子属于分泌蛋白。主要在11.1 %胞核；胞浆44.4 %； 高尔基体33.3 %； 线粒体11.1 %分泌合成中发挥生物学作用。

2.6 TNF-a蛋白翻译后修饰位点分析

在真核生物中，蛋白质翻译后修饰过程常见的有糖基化和磷酸化两种。糖基化通常是修饰天冬酰胺上的N端。其氨基酸的特征序列为 Asn －X－ Ser －Thr， X可表示为任一种氨基酸。机体一些蛋白需要糖分子/糖链等与其它分子相互作用发挥生物学作用； 磷酸化多具有功能开关作用，当机体蛋白被磷酸化后方能具备调控生物体功能代谢的作用；笔者采用在线软件工具Netphos2.0 Server和NetOGlyc4.0 Server对TNF-a蛋白进行预测，其预测表明有 8个 Ser（5,27,68,79,80,81,85,209），3个 Thr（83,165,181），4个Tyr（132,191,195,217）可能成为蛋白激酶磷酸化位点；有下列7个糖基化位点分别为68,71,79,80,81,83,85位点。

图4 TNF-a蛋白翻译后修饰位点分析

2.7 TNF-a蛋白的二级结构分析

多肽链中的主链借助氢键形成有规则卷曲折叠的一维构象为蛋白质二级结构。本研究利用DNAstar在线预测TNF-a蛋白的二级结构和抗原表位（如图 5），综合 Gamien-Robson和Chou-Famsman2两种方法，预测发现TNF-a的二级结构主要是α螺旋结构：28.3% 和18.9%；β折叠：51.5%和41.2% ，转角13.7%和34.3%和无规则卷曲7.73%。根据Jameson woff预测TNF-a的氨基酸，抗原指数最小值是0.6，最大值3.4，平均值0.59，高于3.0的区域主要是20～21, 26,65, 80～82, 86, 177, 216区段，提示该区域可能是优势抗原表位。预测 TNF-a的氨基酸亲水性最小值-2.68，最大值2.60，平均值0.06，在30～55氨基酸明显低于平均值。

图5 TNF-a蛋白的二级结构

3 讨 论

1975 年， CarsweII 等给接种卡介苗的小鼠通过注射脂多糖后，观察发现该鼠血清中含有能引起肿瘤出血坏死的活性因子可，称为肿瘤坏死因子( TNF) 。TNF被分类TNF-α和 TNF-β两大类，其多由活化的单核细胞、巨噬细胞释放产生，又称恶液素。众所周知真核生物如单核细胞等进行蛋白质翻译后的修饰过程主要有蛋白质的糖基化和磷酸化，其中蛋白糖基化主要是修饰天冬酰胺上的N端，这种糖基化修饰可以对免疫分子的结构和功能有一定影响，从而改变机体对抗原的应答反应［4］，同时蛋白糖基化作用与某些疾病也有紧密关系，如艾滋病患者所携带的HIVgp 120位点上的寡甘露糖位点可以成为潜在的治疗靶位点［5］。本研究结果发现NetOGlyc4.0 Server对TNF-a蛋白进行预测，有下列7个糖基化位点分别为68,71,79,80,81,83,85位点，结合蛋白二级结构分析结果， 其中ser68位于α 螺旋上，69leu、71ser和 79ser位于β－折叠片上， 这些不同位点修饰后的TNF与高血压等有密切关系[6,7,8]。笔者采用生物在线软件工具TMHMM2.0Sever对TNF-a蛋白跨膜结构进行分析，结果显示，TNF-a蛋白或许是由跨膜区（35～57位氨基酸）、胞外区（蛋白的 58～233位氨基酸处于细胞膜表面）以及胞内区（1～34位氨基酸）部分构成的膜蛋白。预测TNF-a的氨基酸亲水性在30～55氨基酸明显低于平均值，说明跨膜区域与亲水区域一致，故揣测蛋白可能是一个与细胞信号传导有关的膜受体蛋白。利用神经网络模型NN 和隐马尔可夫模型HMM 进行预测，TNF剪切位点在29～30位氨基酸之间,是具有信号肽的分泌蛋白。肾小管上皮细胞 TLR4 的活化能特异性的激活核因子出( NF-KB) 途径，启动 IL-6、8、12，TNF-α 和辅助刺激因子CD80、 86 等基因的转录， 促使细胞趋化因子的释放以及巨噬细胞的浸润，激活急性肾小管损伤中的免疫应答。TNF-α 在细胞免疫、肿瘤免疫等多种生理和病理过程中发挥关键作用，同时TNF-α 和机体的炎症反应、 免疫反应都有着密切关系［9］。高血压时增高的 IL-6 和TNF-α 提升了机体的炎症免疫反应， 产生过多的免疫复合物，这些免疫复合物可直接增加肾小球通透性，同时可激活补体，产生 C3a、C5a 等趋化因子吸引炎症细胞，释放炎症因子、蛋白溶解酶、活性氧，导致肾组织损害。肿瘤坏死因子-α( TNF-α)是肾脏疾病进展中的重要调节因子之一。

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Bioinformatics prediction of TNF-a gene structure and function

Yu Xin1Yang Zhen2△Chu Yuankui1Zhang Yiqing1YuMeiling1
1 Department of Laboratory Medicine in clinical school, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China; 2 Heart Center, the Affiliated Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China；3 Department of Pharmacy, The Affiliated Hospital of Ningxia Medical University, 750004,Yinchuan, China

Objective:To analysis the bioinformatics of TNF-a gene structure and function.Methods: by means of bioinformatics methods,mainly focused on ananalyzing its encoding protein including its structure ,physical and chemical properties,signal peptide, transmembranes structure, subcellar localization,secondary structure ,higher structure and so on.Results:The results indicated TNF-a protein was stable fat soluble transmembrane protein,located cellular exterior.There are eight phosphorylation sites and seven sugar activation sites ,the secondary structure was primarily composed β fold.Conclusion: TNF - a is a very important cytokines, this study of TNF - a protein structure and function of the bioinformatics prediction, could further strenthen the understand the TNF - a gene and protein effect, and to explore its function and relationship with high blood pressure and inflammation.

TNF-a , Bioinformatics

R737.25

A

1672-5018（2016）11-002-02

国家自然科学基金（81260265）

1.作者简介：于欣(1977-)，副教授，主要从事心血管疾病的临床血液免疫分子生物学实验室研究。△通讯作者，Email: yangzhen080@163.com