金银花叶中绿原酸的纯化工艺研究

唐蕾

江苏省中医院 江苏南京 210029

金银花叶中绿原酸的纯化工艺研究

唐蕾

江苏省中医院 江苏南京 210029

目的探索金银花叶中绿原酸的纯化工艺，使提取物中绿原酸含量在 80%以上。方法运用正交试验法设计洗脱条件，采用Minitab软件分析正交试验结果，并对萃取工艺参数进行了研究。结果1O倍量的75%的乙醇回流提取金银花叶2次，每次1.5h，过滤，浓缩至无醇味，调节pH至2.5，以16mL/min速度上样，1倍柱体积纯水冲洗，再以10%的乙醇10个柱体积以10～15 mL/min的流速洗脱，洗脱液浓缩至药材：药液＝2:1的浓度，用等量乙酸乙酯萃取8次，合并萃取液后浓缩干燥，所得提取物中绿原酸含量达90%以上，绿原酸的转移率77%左右。结论该法所得提取物绿原酸含量80%以上，可作为开发5类新药的原料。

金银花叶；绿原酸；提取纯化；大孔树脂；萃取

金银花为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或带初开的花，功能主治：清热解毒，疏散风热。用于痈肿疔疮，喉痹，丹毒，热毒血痢，风热感冒，温病发热[1]。金银花中绿原酸类成分为金银花的抗菌有效成分，因而绿原酸的含量高低为评价金银花优劣的标准[2]。也有文献报道其叶中亦含有丰富的绿原酸，其含量略低于花，但总黄酮含量稍高，且叶的产量大、资源丰富[3]，因而本文以金银花叶为原料、绿原酸为指标考察提取纯化工艺，使得提取物中绿原酸的含量在80%以上，可作为5类新药开发。

1.材料与方法

1.1 材料

金银花叶（产地：山东平邑，药典方法测定绿原酸含量2.45%）批号为 140601，绿原酸对照品（购自中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号:110753-200413），乙腈为色谱纯，磷酸、乙酸乙酯为分析纯，乙醇为食用级，D101树脂。岛津高效液相色谱仪，DAD检测器，BUCHI旋转蒸发仪，梅特勒电子分析天平。

1.2 方法

1.2.1 金银花叶中绿原酸的含量测定

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈—0.4%磷酸溶液（13：87）为流动相；柱温：25℃；检测波长：327nm。理论塔板数按绿原酸峰计算不低于1000。

对照品溶液：精密称取绿原酸对照品适量，置棕色量瓶中，以50%甲醇制成每1mL含40μg的溶液，即得（10℃以下保存）。

供试品溶液：取金银花叶粉末（过四号筛）约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50%甲醇50mL，称定重量，超声处理（功率250W，频率35kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5mL，置25mL棕色量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，即得。

样品测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL注入液相色谱仪，测定，即 得。

1.2.2 金银花叶中绿原酸的提取

绿原酸、异绿原酸在水和乙醇中的溶解性都比较好，文献报告金银花叶中醇提的成分对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有抑菌效果[4]。醇浸水提法提取金银花叶中的绿原酸得率为6.86%[5]。武达等[6]比较了传统水煎法、乙醇回流法、超声提取法对金银花中绿原酸提取率的影响，结果1O倍量的75%的乙醇回流提取2次，每次1.5h的工艺绿原酸提取率最高。

我们选择武达等报道的工艺，并进行验证：称取干燥的金银花叶3kg，平均分成三份，每份用1O倍量的75%的乙醇回流提取1.5h，过滤，再加入1O倍量的75%的乙醇回流提取1.5h两次，过滤，合并滤液，得提取液。取上述提取液（相当于生药材量0.5g），置蒸发皿中，50℃水浴蒸干，残渣用50%甲醇充分溶解并定容至100mL，摇匀，过滤，得供试品溶液。按照1.2.1中方法测定提取液中绿原酸含量，计算绿原酸转移率。

1.2.3 金银花叶提取液中绿原酸的纯化工艺

文献报道提取溶液调至酸性，上D101树脂后水洗，再收集醇洗溶液，浓缩后乙酸乙酯萃取的方法可富集绿原酸[7-8]。根据文献上样液的pH控制在2-3之间，最佳2.5，因而上样前应调提取液pH至2.5，并进一步考察其他参数。

称取金银花叶2kg按照1.2.1中的方法提取，所得提取液浓缩至无醇味，调提取液pH至2.5，置冰箱中待用。

1.2.3.1 树脂用量的考察

D-101大孔树脂100g，装于长50cm，直径3cm的玻璃柱中，共 4根，水洗好，备用。分别取相当于含 20g，40g，60g，80g生药材的提取液以2mL/min流速上样。再加一倍柱体积水洗，合并上样残液和水洗液，待用。吸取上述溶液各 50mL，置蒸发皿中，50℃水浴蒸干，残渣加50%甲醇充分溶解并定容至10mL，摇匀，过滤，按照1.2.1中方法测定溶液中绿原酸的量。

1.2.3.2 上样水洗速度考察

称取D-101大孔树脂100g，装柱，柱长50cm，直径3cm，平行4根，水洗好，备用。分别取1.2.2制备的浓缩液四份，每份相当于生药材40g，分别以8、12、16和20mL/min的速度上样，上样完毕后加一倍柱体积水洗，合并上样残液和水洗液，待用。精密吸取上述溶液各 10mL，置蒸发皿中，50℃水浴蒸干，残渣加50%甲醇充分溶解并定容至10mL，摇匀，过滤，按照1.2.1中方法测定溶液中绿原酸的量。

1.2.3.3 洗脱条件的选择

文献报道，碱性去离子水或低浓度的乙醇溶液可用于绿原酸的洗脱[9]，因而本文选用低浓度的乙醇作为洗脱溶剂。以乙醇的浓度A、洗脱速度B 以及洗脱体积C为因素，各选三个水平，以L9（34）进行正交试验，因素水平表见表1。

表1 因素水平表

称取D-101大孔树脂100g，装柱，柱长50cm，直径3cm，平行9根，水洗好，备用。分别取1.2.2制备的浓缩液9份，每份相当于生药材40g，按照表4的试验安排用A浓度的乙醇C柱体积以B流速洗脱，收集洗脱液。吸取洗脱液1mL，置蒸发皿中，50℃水浴蒸干，残渣加50%甲醇充分溶解并定容至10mL，摇匀，过滤，按照1.2.1中方法测定溶液中绿原酸的量，计算绿原酸的转移率。

运用Minitab软件对试验结果进行分析，确定最佳工艺。

1.2.3.4 洗脱工艺验证

称取D-101大孔树脂100g，装柱，柱长50cm，直径3cm，平行3根，水洗好，备用。取1.2.2制备的浓缩液3份，按照最佳洗脱工艺10%的乙醇10个柱体积以10-15 mL/min的流速洗脱，收集洗脱液，按照 1.2.1中方法测定溶液中绿原酸的量，计算绿原酸的转移率。

1.2.3.5 萃取工艺参数确定

经洗脱后提取物的绿原酸转移率达88%左右，但绿原酸含量未达到80%，文献报道[10]可用石油醚、乙酸乙酯萃取的方式提纯绿原酸。本文选择乙酸乙酯最为萃取溶剂。取2.4kg金银花叶，按照优选的工艺提取纯化，得洗脱液。将洗脱液平均分成6份，其中3份分别浓缩至药材：药液＝2:1，4:1，6:1，等量乙酸乙酯萃取10次，合并每2次乙酸乙酯液。按照1.2.1中方法测定每份萃取溶液中绿原酸的量，计算绿原酸的转移率。

剩余3份按照最佳的萃取后，浓缩、干燥，得提取物，测定提取物中绿原酸的转移率及含量。

2.结果

2.1 金银花叶中绿原酸的提取

结果3次平行试验中绿原酸的转移率分别为91.92%、90.33%和92.82%，平均值为91.69%。

2.2 树脂用量的考察

结果四根树脂柱吸附绿原酸的量分别为0.49、0.98、1.42和1.43g， 表明100g D-101树脂可吸附绿原酸的量为1.4g，即绿原酸与树脂的比为1.4：100，为防止大生产中绿原酸的损失，绿原酸与大孔树脂的比选择1：100，即40g绿原酸含量为2.45%的金银花叶提取得到的药液需用D-101树脂约100g。

2.3 上样水洗速度考察结果

结果表明，上样速度为8、12、16 mL/min时，绿原酸能被完全吸收，当速度达到20mL/min时绿原酸不能被完全吸收，因而上样速度选择16 mL/min。

2.4 洗脱条件优选结果

结果见表2正交试验结果表、表3均值相应表。

表2 正交试验结果

表3 均值响应表

由结果可知，最佳工艺为A1B1C3，即10%的乙醇10个柱体积以10-15 mL/min的流速洗脱，乙醇的用量对绿原酸的转移率的影响最大，其次是乙醇浓度，影响最小的为乙醇的洗脱速度。乙醇用量越大，浓度越小，洗脱速度越小，绿原酸的转移率越高。

运用Minitab软件对最佳工艺A1B1C3的结果进行预测，预计绿原酸的转移率为88.34%。

2.5 洗脱工艺验证结果

结果三次试验绿原酸的转移率分别为 87.25%、88.94%、87.98%，与预测结果相符。

2.6 萃取工艺研究结果

结果表明，浓缩至药材：药液=2:1的浓度，用等量乙酸乙酯萃取8次，合并萃取液后浓缩干燥即可。验证结果表明，最终提取物中绿原酸转移率为77.21%，含量为91.24%。

表4 萃取工艺研究结果

3.讨论

金银花叶中绿原酸以游离态和结合态（盐）共同存在，降低pH可使结合态的绿原酸转化为游离态，因而上大孔树脂柱前将提取液pH调节至2.5使其以游离态存在，以提高吸附量，从而提高得率。绿原酸具有酚羟基结构，有一定的亲水性和极性，与弱极性和极性树脂易于发生吸附作用，经试验选择了极性树脂D101。

一般金银花的入药部位为花蕾或初开的花，随着对其化学成分的研究发现其叶中亦有丰富的绿原酸，金银花价格较贵，采用来源丰富的金银花叶可以降低成本。采用本文最终的工艺所制得的提取物中绿原酸含量达90%以上，可将其作为中药5类新药开发，具有极高的开发价值。

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1672-5018（2016）11-015-02