韭菜水提液对甘蓝枯萎病菌抑制作用初探

曾 凤 黄永红 凌 键 茆振川 谢丙炎 杨宇红

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京100081）



韭菜水提液对甘蓝枯萎病菌抑制作用初探

曾 凤 黄永红 凌 键 茆振川 谢丙炎 杨宇红*

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京100081）

摘 要：采用离体抑菌测定和盆栽测定相结合的方法，研究了韭菜水提液对甘蓝枯萎病菌1号生理小种的抑制作用和盆栽防治效果。结果表明：韭菜水提液对甘蓝枯萎病菌的菌丝生长速率以及孢子萌发率具有明显的抑制作用，当韭菜水提液浓度为0.75 g·mL-1时，菌丝生长抑制率达到100%；当韭菜水提液浓度为0.25 g·mL-1，处理20 h后观察，孢子萌发抑制率达95.47%；在盆栽试验中，基质中加入韭菜水提液浓度为0.086 g·g-1接种15 d后，甘蓝枯萎病的防治效率可达40%，甘蓝死亡率下降27%。

关键词：韭菜；水提液；甘蓝枯萎病菌；盆栽试验；抑制率

曾凤，女，硕士研究生，专业方向：分子植物病理学，E-mail：474249677@qq.com

结球甘蓝起源于地中海至北海沿岸，是世界上许多国家的主要蔬菜之一。目前，我国甘蓝年种植面积约为90万hm2（杨丽梅 等，2011），在蔬菜的周年供应和出口创汇方面起着重要作用。甘蓝枯萎病作为甘蓝上的重要病害之一，1895年在美国首次发现（Smith，1899），如今在我国北京、河北等地发生并传播迅速（李明远 等，2003），严重时甚至会导致毁收绝产，使甘蓝种植产业蒙受巨大损失。当前甘蓝枯萎病的防治方法主要包括农业防治、生物防治、化学防治等。农业防治主要包括种子处理、轮作、清理病残体以及选用抗病品种等，但是前几种方法收效甚微，虽抗病品种防效很好，但目前国内的抗病资源缺乏。而化学防治缺乏有效的药剂。生物防治及其相关产品的开发成为目前研究热点。其中，植物源杀菌剂是利用具有杀菌、抑菌活性的某些植物部位或提取其有效成分，或分离纯化其单体物质加工成用于防治病害的药剂（李晓东 等，1995）。已有报道证实许多植物提取液以及分泌物能有效抵御病原菌的侵染，如韭菜提取液对香蕉枯萎病菌的菌丝以及孢子的抑制率可达98%，葱汁液以及葡萄叶提取物也可抑制黄萎菌，另外有研究分析了植物源农药解决病原菌抗药性问题的可能性（何衍彪 等，2005；田菲菲 等，2006；周璇 等，2007；冯岩 等，2010；黄永红 等，2011；叶倩 等，2013）。

在前人研究的基础上，本试验探究了韭菜提取液对甘蓝枯萎病菌菌丝生长速率、孢子萌发率的影响以及盆栽防治效果，旨在为甘蓝枯萎病的绿色防治提供新的思路。

1　材料与方法

1.1试验材料

供试菌株：尖孢镰刀菌甘蓝专化型（Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans）1号生理小种52557-TM（Foc）的标准菌株，由美国菌种保存中心（ATCC）提供，中国农业科学院蔬菜花卉研究所真菌病毒组保存。供试品种：韭菜品种为四季香韭，由北京鑫农丰农业技术研究所选育而成；甘蓝品种为中甘21号，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所选育而成。

1.2试验设计

试验于2015年5月1日至7月30日在中国农业科学院蔬菜花卉研究所真菌病毒组实验室进行。

1.2.1韭菜水提液对甘蓝枯萎病菌的离体抑制测定

1.2.1.1韭菜水提液制备 取洗净晾干的韭菜100 g ，切成5 cm的小段，加20 mL蒸馏水，用榨汁机打碎，装入离心管，5 000 r·min-1离心10 min，取上清液，共离心4次，直至上清液呈透明色，再用0.22 μm细菌过滤器过滤上清液，得到浓度为5.0 g·mL-1的水提原液，4 ℃保存备用。

1.2.1.2对菌丝生长速率的抑制测定 取Φ9 cm的培养皿，分别加入0、1、2、3 mL的上述韭菜水提原液，用无菌蒸馏水将体积补充至3 mL。将冷却至37 ℃左右的PDA培养基倒入上述不同处理的培养皿中，每皿20 mL，混匀，此时韭菜水提液浓度分别为0（CK）、0.25、0.50、0.75 g·mL-14个浓度梯度。取一新鲜Foc平板，用Φ0.8 cm打孔器打成大小一致的菌饼，取1个菌饼倒置接到各处理的培养基平板中央，每个浓度梯度重复3皿，28 ℃培养箱培养8 d，每天采用“十”字交叉法测量菌落大小，计算菌丝生长抑制率。

抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%

1.2.1.3对孢子萌发的抑制测定 在500 mL的三角瓶中加入PDB培养基200 mL，接入Foc菌丝进行培养，28 ℃、150 r·min-1摇培4 d后，用4层擦镜纸过滤（Li et al．，2015），5 000 r·min-1离心10 min后收集孢子。将收集的孢子用新的PDB培养基进行稀释，调整孢子浓度为1×107个·mL-1，取200 μL分别添加到12个装有500 μL PDB培养基的2.0 mL离心管中。再分别加入0、50、100、200 μL上述韭菜水提原液，最后用无菌水补充总体积为1 mL，此时韭菜水提液被稀释成0（CK）、0.25、0.50、1.00 g·mL-1。每处理3次重复，每重复总共200 μL，10、20 h后，用普通光学电镜观察孢子萌发情况，每个重复观察3次，共观察约100个孢子。

孢子萌发率=萌发孢子总数/孢子总数×100%

孢子萌发抑制率=（对照孢子萌发率-处理孢子萌发率）/对照孢子萌发率×100%

1.2.2韭菜水提液对甘蓝枯萎病的盆栽防效测定

1.2.2.1韭菜水提液制备 取洗净晾干的韭菜200 g，切成5 cm的小段，加100 mL水，用榨汁机打碎，加水至1 000 mL，配制成0.2 g·mL-1的溶液备用。

1.2.2.2土壤处理 分别取0、15、30 mL上述韭菜提取液，与70 g的基质混匀，装入营养钵中，此时韭菜水提液浓度分别为0（CK）、0.043、0.086 g·g-1。每处理3次重复，每重复种15～20株甘蓝苗。

1.2.2.3盆栽接种 将3叶1心期的甘蓝幼苗在浓度为1×106个·mL-1的甘蓝枯萎病1号生理小种孢子悬浮液中浸泡20 min，移栽到上述营养钵中，放入28 ℃温室中培养，8 d后开始调查植株发病情况，并根据病情分级标准，统计病情指数。

分级标准：0级，无症状；1级，1片叶轻微变黄；2级，1～2片叶叶脉轻至中度变黄：3级，除心叶外，其余叶片中度变黄或萎蔫；4级，全部叶片重度变黄或萎蔫；5级，叶片完全萎蔫并变黄（Li et al．，2015）。

病情指数=Σ（各级发病数×各级代表值）/（处理总数×最高级代表值）×100

2　结果与分析

2.1韭菜水提取液对菌丝生长的抑制作用

图1　韭菜水提液对甘蓝枯萎病菌菌丝生长速率的影响

图2　接种后6 d韭菜水提液对甘蓝枯萎病菌的抑制效果

韭菜水提取液对甘蓝枯萎病菌菌丝的生长速率具有明显的抑制作用，随着提取液浓度的增大，抑制作用增强；接种6 d后，当浓度达到0.75 g·mL-1时，病原菌完全停止生长，抑制率达到100%（图1、2）。

2.2韭菜水提液对甘蓝枯萎病菌孢子萌发率的影响

由图2可知，在浓度为0.25 g·mL-1韭菜提取液的PDB培养基中，甘蓝枯萎病菌的孢子萌发明显受到抑制，10 h后处理萌发率仅有0.65%，对照为21.16%；20 h后处理萌发率为2.56%，而对照高达56.57%，抑制率可达95.47%（图3）。视野中几乎未看到明显的孢子萌发痕迹（图4）。

图3　韭菜水提液对甘蓝枯萎病菌孢子萌发率的影响

图4　接种后20 h孢子萌发情况（光学电镜，20×）

图5　韭菜水提液对甘蓝枯萎病的盆栽防效

图6　接种后第16天甘蓝幼苗的生长情况

2.3韭菜水提液对甘蓝枯萎病的盆栽防效

由图5可知，随着处理土壤中加入韭菜水提液浓度的增加，甘蓝枯萎病病情指数显著降低。当接种14 d时，对照的病情指数为61.38，而韭菜水提液浓度为0.043 g·g-1和0.086 g·g-1处理的病情指数分别为42.73、11.33，防治效果分别达到30.39%、81.54%；韭菜水提液浓度为0.086 g·g-1处理接种15 d时对甘蓝枯萎病的防效可达40%，甘蓝死亡率下降27%，说明韭菜提取液对减轻甘蓝枯萎病发病程度具有很好的作用；接种16 d后，对照几乎全部死亡，而韭菜水提液浓度为0.043 g·g-1和0.086 g·g-1处理的甘蓝苗仍可正常生长，尤其是韭菜水提液浓度为0.086 g·g-1的处理长势良好（图6）。但是接种后15 d防效有所降低，表明其持效期可能为14 d左右。

3　结论与讨论

甘蓝枯萎病是土传性病害，可以通过多种方式进行传播，如地下昆虫、水流以及农事操作等，有时种子也可以带菌传播，而近年来发生情况愈加严重，危害面积快速上升，可造成甘蓝产量损失高达30%以上（张扬 等，2007）。目前很难找到有效、安全的方法防治该病害，所以寻找一种高效、无毒的防治方法具有非常重要的意义。

本试验通过研究韭菜水提液对甘蓝枯萎病病原菌的作用，从菌丝生长、孢子萌发以及病原菌致病力等方面展开试验，结果表明：韭菜粗水提液对甘蓝枯萎病菌具有明显的抑制作用，这为甘蓝枯萎病的防治提供了一种新的参考。但是，本试验只是初步试验，不够深入，如何进一步研究韭菜水提液的杀菌活性以及获得韭菜中的杀菌物质，并运用到大田中还需要继续思考。韭菜及其相关产物的开发利用，可能为将来病害的防治提供了高效、安全、环境友好型的新型药剂。

参考文献

冯岩，杨静美，王晓容，林嘉旋，夏恭澍，刘开启．2010．韭菜和葱汁液对香蕉枯萎病菌的抑制作用．华中农业大学学报，29 （3）：292-294．

何衍彪，詹儒林，赵艳龙，马蔚红．2005．20种植物提取物对芒果炭疽菌的抑制作用．热带作物学报，26（3）： 86-90．

黄永红，李春雨，魏岳荣，左存武，易干军．2011．韭菜对香蕉枯萎病菌的拮抗及其对盆栽香蕉枯萎病发生的抑制作用．浙江农业学报，23（6）：1162-1166．

李明远，张涛涛，李兴红．2003．十字花科蔬菜枯萎病及其病原鉴定．植物保护，29（3）：44-45．

李晓东，陈文奎，胡美英．1995．印楝素、闹羊花素—Ⅲ对斜纹夜蛾的生物活性及作用机理的研究．华南农业大学学报，16（2）：80-85．

田菲菲，孙明清，蒋继志，王树桐，李召春，朱杰华．2006．植物提取物对黄瓜炭疽病菌的抑制作用．中国农学通报，22（12）：327-330．

杨丽梅，方智远，刘玉梅，庄木，张扬勇，孙培田．2011．“十一五”我国甘蓝遗传育种研究进展．中国蔬菜，（2）：1-10.

叶倩，李春雨，易干军．2013．葱、姜、蒜、韭菜提取液对香蕉枯萎病抑菌作用的比较分析．北京农业，（21）：45-46．

张扬，郑建秋，吴学宏，师迎春，谷培云，李健强．2007．北京延庆甘蓝枯萎病发生和危害调查． 中国农学通报，23（5）：315-320．

周璇，周宝利，李志文，董春风．2007．抑制茄子黄萎菌的植物提取物的筛选．生态学杂志，26（8）：1217-1221．

Li E F，Wang G，Yang Y H，Xiao J L，Mao Z C，Xie B Y．2015．Microscopic analysis of interactions between Fusarium oxysporum f. sp. congutinan and cabbage．Eur J Plant Pathol，141：597-609．

Smith E．1899．The fungous infestation of agricultural soils in the United States．Scientific American Supplemen，48：19981-19982.

Primary Studies on Inhibitory Effect of Water Extracts from Allium tuberosum on Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans in Cabbage

ZENG Feng，HUANG Yong-hong，LING Jian，MAO Zhen-chuan，XIE Bing-yan，YANG Yu-hong*
（Institute of Vegetables and Flowers， Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）

Abstract：This paper studied the inhibition role of water extracts from Allium tuberosum on Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans（Foc）and control effect of pot cultivation by combining in vitro antibacterial assay with potted plant measurement. The result indicated that extracts could clearly suppress mycelia growth and spore germination．The inhibition rate was up to 100% when the concentration of waterextracts reached 0.75 g·mL-1. The spore germination inhibition rate reached 95.47% when the added leek extract concentration came to 0.25 g·mL-1and was deal with 20 hours. In pot experiments， the disease control efficiency can reach 40%，and mortality fell by 27% 15 days after the treatment when the concentration of waterextracts reached 0.086 g·g-1in the culture substrate.

Key words：Allium tuberosum；Water extract；Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans；Potted plant experiment；Inhibition rate

*通讯作者（

Corresponding author）：杨宇红，女，研究员，专业方向：植物病理学，E-mail：yangyuhong@caas.cn

收稿日期：2015-08-19；接受日期：2015-11-09

基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项（201303014），现代农业产业技术体系建设专项（CARS-25-B-01），中国农业科学院创新工程项目（CAAS-ASTIP-IVFCAAS），农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室项目