响应面法优化超声波辅助提取桑叶多酚工艺

代燕丽 沈维治 廖森泰 刘凡 王思远 胡根腾 邹宇晓

摘 要 以‘粤椹大10品种的桑叶粉为原料，选择乙醇浓度、料液质量浓度、超声时间、超声功率、超声次数等5个因素做单因素实验，在这个基础上采用Box-Behnken中心组合试验设计法进行3因素3水平的实验，得到桑叶多酚提取的最佳工艺参数。最终得出的最佳提取工艺条件为：提取次数1次、超声功率400 W、乙醇浓度70%（V/V）、料液质量浓度0.030 g/mL、超声时间60 min，在此条件下桑叶多酚含量为8.33 mg/g。此结果的模型适合桑叶多酚超声波提取，可用于实际生产。

关键词 桑叶多酚；超声波；提取；响应面；工艺优化

中图分类号 TQ461；S888 文献标识码 A

Abstract The leaf powder of the mulberry variety‘Yueshen Da 10was used as the material. The box Behnken design was used to establish a quadric regression equation for predicting the yield of total polyphenols based on five factors including ethanol concentration， solid to solution ratio， ultrasonic treatment time， ultrasonic treatment power and ultrasonic treatment times. The optimized extraction conditions with a polyphenol yield of 8.33 mg/g were ethanol concentration 70%（V/V）， solid to solution ratio 0.030 g/mL， ultrasonic treatment time 60 min under ultrasonic treatment power 400 W for one time. The results of the model is fit for mulberry leaf polyphenol extraction and can be used in actual production.

Key words Mulberry leaf polyphenol； Ultrasonic； Extraction； Response surface methodology； Process optimization

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.08.023

桑叶，为桑属（Morus L.）桑科植物的叶，在全国大部分地区都有生产，品种资源极其丰富。现在研究证明，桑叶除了可用于蚕属养殖外，在众多领域都具有价值。而桑叶本身具有抗氧化、抗衰老、降血脂、降血糖、及抗癌等药理活性，其中最主要的物质基础[1]就是含有丰富的植物多酚，像绿原酸、芦丁、安息香酸等单体酚类化合物的含量最为突出。沈维治等[2]已经做过有关桑叶多酚的含量与体外抗氧化能力的研究，研究证明桑叶多酚的抗氧化能力的生物活性与总多酚含量的相关性都达到极显著水平（p<0.01），表明桑叶总多酚是桑叶抗氧化作用的重要物质基础之一。由此，提高桑叶多酚的提取含量，对获得更高生物活性的物质具有一定意义。超声波辅助提取技术具有强大的超声波能量，可以破碎植物细胞，改变原料的物化特性，加速目标物质的溶出[3]，是一种便捷、高效的提取方法，有研究报道超声设备的功率和时间与提取产物的组成和数量密切相关[4-5]。目前，通过响应面分析法优化超声波辅助提取桑叶多酚的研究还鲜有报道。本实验将研究超声波辅助法提取桑叶多酚工艺条件中料液质量浓度、乙醇体积分数、超声时间和超声功率等因素对桑叶多酚提取含量的影响，并通过响应面方法进行优化，研究结果能为桑叶资源的高附加值利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 ‘粤椹大10品种，于2015年3月中旬在广东省农业科学院白云基地桑园采收。控制热风干燥箱温度为60 ℃，将样品烘干至恒定重量，中药粉碎机粉碎后过60目筛，-20 ℃阴暗环境贮藏备用。

1.1.2 试剂 Folin-Ciocalteu 试剂购自广州市齐芸生物技术有限公司，无水碳酸钠、无水乙醇、没食子酸等试剂都为国产分析纯级。

1.1.3 仪器 永康市敏业工贸有限公司的百丽福-150中药粉碎机，上海一恒科学仪器有限公司的电热恒温鼓风干燥箱，宁波新芝生物科技股份有限公司的SB25-12DTD超声波清洗机，苏州赛恩斯仪器有限公司的Thermo赛默飞世尔冷冻高速离心机Sorvall Strato，日本岛津的UV-1800紫外分光光度计，上海爱朗仪器有限公司的EYELA-1001旋转蒸发仪。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线的建立 采用Folin-Ciocalteu[6]法以没食子酸为标准品建立标准曲线。准确称取10 mg没食子酸标准样品，去离子水定容至100 mL，配制成100 μg/mL标准样品母液。将母液进行稀释，配成浓度为4、6、8、10、12、14、16 μg/mL浓度的10 mL标准溶液。分别取1 mL不同浓度标准溶液、2 mL的10% Na2CO3溶液、1 mL福林-酚试剂振荡混匀[7]，避光常温反应1 h，在765 nm波长处用紫外分光光度计测定混合反应液的吸光度，每个试验设置3个平行，取其平均值。实验结果分别以没食子酸质量浓度（μg/mL）、吸光度（OD）为X轴和Y轴，制作标准曲线并得出回归方程和回归系数。

1.2.2 桑叶多酚提取方法 准确称取贮藏备用的‘粤椹大10桑叶粉加入不同浓度的乙醇，混合均匀后置入超声环境（SB25-12DTD超声波清洗机）下提取，旋转蒸发仪减压浓缩，用容量瓶定容到一定体积，按标准曲线建立的检测方法检测其中的多酚含量。每个样品重复测定3次。

1.2.3 单因素试验 分别研究乙醇浓度[50%、60%、70%、80%、90%（V/V），固定料液质量浓度为0.025 g/mL、超声时间45 min、超声功率400 W、提取1次]、料液质量浓度（0.020、0.025、0.030、0.035、0.04 g/mL，固定乙醇浓度70%、超声时间45 min、超声功率400 W、提取1次）、超声时间（15、30、45、60、75 min，固定乙醇浓度70%、料液质量浓度0.03 g/mL、超声功率400 W、提取1次）、超声功率（100、200、300、400、500 W，固定乙醇浓度70%、料液质量浓度0.03 g/mL、超声时间60 min、提取1次）、提取次数（1、2、3次，固定乙醇浓度70%、料液质量浓度0.03 g/mL、超声时间60 min、超声功率400 W）对桑叶多酚提取率的影响。实验进行5个单因素试验，为后面响应面优化试验做准备。

1.2.4 响应面优化试验 经过单因素试验研究，选出对桑叶多酚含量影响合适的因素和水平，根据Box-Benhnken原理，用软件设计试验，进行响应面分析优化，获得的试验数据进行多元回归拟合分析，得到最佳提取条件后并进行验证试验。每个试验重复3次。

1.3 统计分析

采用SPSS19.0软件对单因素试验数据进行方差分析，并进行Tukey HSD差异显著性分析（p<0.05表示差异显著）。采用Expert-Design8.0.6分析响应面优化的数据建立回归方程。

2 结果与分析

2.1 没食子酸标准曲线

分别以没食子酸质量浓度（μg/mL）吸光度（765 nm）为横纵坐标，做出标准曲线并得出回归方程与回归系数（图1）。回归方程为：y=0.053 1x+0.024 7，R2=0.999 3，表明没食子酸浓度与吸光度在0～20 μg/mL范围内，呈现良好的线性关系。

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇浓度对桑叶多酚提取含量的影响 由图2可知，乙醇浓度对桑叶多酚提取含量的影响是呈规律性变化的，在乙醇浓度达到70%时，桑叶提取物多酚含量最高。在70%浓度以后，桑叶多酚提取含量逐渐降低，可能是因为溶剂挥发量增大，使桑叶粉得不到充分溶解，还有就是有部分醇溶性杂质溶出增加，干扰多酚化合物浸出。因此，乙醇浓度过低或过高均不利于桑叶多酚的提取，综合生产成本和提取得率，选择60%、70%、80% 这3个水平进行响应面优化试验。

2.2.2 料液质量浓度对桑叶多酚提取含量的影响

从图3可知，料液质量浓度对桑叶多酚含量的影响在0.030 g/mL时达到峰值，之后再增加料液质量浓度桑叶多酚含量逐渐降低，可能是溶剂体积一旦增大，其他一些可溶性的杂质溶解的量也逐渐增大，使得多酚提取含量减少。因此，选择料液质量浓度0.025、0.030、0.035 g/mL 这3个水平进行进一步的响应面试验。

2.2.3 超声时间对桑叶多酚提取的影响 从图4可以看出，在超声时间60 min之前，随着超声时间的延长，桑叶多酚含量增加，当超声时间到60 min以后再延长时间，多酚含量基本不变或有所降低，可能是因为超声波强大的机械剪切作用对多酚类物质造成破坏所致[8]，还有随着超声时间越来越长，更多其他非多酚类杂质的溶出影响了多酚的提取。根据实验结果，选取45、60、75 min 3个水平进行响应面试验。

2.2.4 超声功率对桑叶多酚提取的影响 从图5可以看出，超声波功率对桑叶多酚含量的影响从100 W到400 W是逐渐上升的，之后再增加超声波功率，桑叶多酚含量基本保持不变。从节省能源的角度选择400 W的超声功率进行提取。

2.2.5 提取次数对桑叶多酚提取的影响 从图6可以看出，提取次数对桑叶多酚提取含量影响不大，基本上没有影响。提取1次后桑叶多酚含量已经达到稳定，提取次数再增加，桑叶多酚含量也不会有太大增加。因此选择1次提取次数，这个因素不应用于响应面优化分析。

2.3 响应面优化试验

2.3.1 试验选择的三因素三水平 综合以上单因素试验，采用Expert-Design8.0.6软件将料液质量浓度、乙醇浓度、超声时间3个对桑叶多酚提取含量影响较大的因素做响应面优化，确定相应的3水平（表1）并根据实验设计进行试验，得到最优提取方法。

2.3.2 响应面试验 按照Box-Behnken中心组合试验设计原理，得到桑叶多酚最优提取方案及结果（表2），回归方程和方差分析结果（表3）。桑叶多酚超声提取的回归方程为：

y=8.33-0.17x1+0.045x2+0.056x3-0.28x1x2-0.22x1x3-0.11x2x3-0.62x12-0.4x22-0.23x32

式中x1为乙醇浓度，x2为料液质量浓度，x3为超声时间，y为多酚含量。

由表3可知，失拟项P=0.241 2不显著，模型p<0.0001，说明模型方程回归显著，拟合程度较好。料液质量浓度、超声时间、料液质量浓度超声时间的交互作用不显著，但其他相均显著；相关系数R2=0.960 5，表明自变量与相应值之间的关系显著。综合上述分析，3个因素对桑叶总酚提取都是极显著的影响（p<0.01）。

2.3.3 响应面图分析 根据回归方程的结果，可以绘制出对应的响应面分析图，直观反映各因子的交互作用。从图7立体图中可以看出，乙醇浓度的变化曲面较陡，说明乙醇浓度对桑叶多酚含量影响大，与回归方程得到的结果一致。从图7的等高线图可以看出，轴向乙醇浓度相对于料液质量浓度等高线密集，表明乙醇浓度对桑叶多酚含量影响较大，而料液质量浓度对桑叶多酚含量影响小。两者交互作用围成的等高线呈椭圆形，且等高线最小椭圆的中心在所选范围之内，表明响应值（桑叶多酚提取含量）在3个因子设计的范围存在最大值[9]。图8中的乙醇浓度和超声时间的交互作用显示，随着乙醇浓度增大和超声时间的延长，桑叶多酚提取含量先升高后降低，在乙醇浓度接近70%，超声时间60 min时的椭圆中心达到最大值，从而可以得出，保持适宜的乙醇浓度和超声时间有利于促进桑叶多酚的提取；而就等高线密集程度来看，超声时间比乙醇浓度对桑叶多酚提取含量的影响小。图9中的料液质量浓度和超声时间的交互作用显示，随着料液质量浓度增加和超声时间延长，桑叶多酚的提取含量先升高后降低，在椭圆的中心位置料液质量浓度为0.030 g/mL、超声时间60 min时，提取含量达到最大，而料液质量浓度和超声时间的变化曲面相对平缓，说明这两个因素对桑叶多酚含量影响不大，与上边方差分析结果一致。

2.3.4 确定最佳工艺条件 通过响应面分析，实际中，桑叶多酚提取的多酚含量最高是8.35 mg/g，表4可见，此含量下对应的各因素条件为：乙醇浓度68.10%、料液质量浓度0.030 g/mL、超声时间62.78 min。结合实际的操作条件，将最佳的工艺条件调整为：乙醇浓度70%、料液质量浓度0.030 g/mL、超声时间60 min，在此条件下进行试验验证，得到多酚含量为8.33 mg/g，与理论值非常接近。

3 讨论

响应面分析法是根据多元二次回归方程作为函数估算工具，拟合因素与响应值之间的函数关系，来寻求最优工艺参数[10]。近年来，许多活性成分如多糖[11]、多酚[12]、花色苷[13]等的提取是运用响应面分析法辅助传统有机溶剂进行提取试验，在实验过程中利用超声波、微波等辅助提取植物活性物质成分，有效提高了生产效率和提取率。其中超声波辅助提取法[14]是利用超声波辐射压强产生强烈的物理效应[15]，使溶剂内所有的分子振动频率增加，加速目标成分进入溶剂，提高目标成分的提取率。

植物多酚包括可溶性酚和不溶性酚，组成复杂，在植物组织中的分布存在很大差异，因此提高桑叶多酚的提取含量应考虑到多个方面。前人在桑叶多酚提取工艺方面已经有一些研究报道，杨上莺等[16]用正交设计的方法考察了桑叶多酚的制备工艺，该法与响应面法相比具有试验方法繁杂、精度偏低等局限性。丁双华等[17]利用响应面法优化桑叶多酚的乙醇浸提工艺，采用的是普通提取方法，未用到超声波辅助提取，而普通提取方法繁琐复杂，操作起来费时费力。本研究正是综合响应面以及超声辅助提取的各项优点，以超声时间、超声功率、料液质量浓度、提取溶剂等作为考察指标，全方位综合试验得到桑叶多酚提取的最佳工艺条件。

通过单因素试验，选择对多酚含量影响较大的因素，通过Box-Behnken中心组合试验设计试验方案并进行试验，通过实验得到的结果建立桑叶多酚超声提取回归方程，并进行实验验证，结果证明该模型的拟合度好。响应面图分析得出，乙醇浓度极显著的影响桑叶多酚的提取含量，而料液质量浓度和超声时间对其影响不显著。乙醇浓度和料液质量浓度两两交互作用、乙醇浓度和超声时间两两交互作用对桑叶多酚的含量影响显著。

实验的最终结果明确并简化了桑叶多酚的提取工艺，能更好的提供生物活性高的植物多酚样品，并为以后批量生产桑叶多酚提供理论依据，提高桑叶的利用率。

4 结论

本研究通过响应面法优化超声波辅助桑叶多酚提取工艺，得到最佳提取工艺为：乙醇浓度为70%，料液质量浓度为0.030 g/mL，超声时间为60 min，超声功率为400 W，提取1次，桑叶多酚提取含量为8.33 mg/g，达到理论预测值的98.8%，表明建立的二次数学模型对桑叶多酚提取工艺条件拟合度好。

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