抗感黄曲霉花生种质遗传多样性评价与指纹图谱构建

闫彩霞 张浩 张廷婷 赵小波 李春娟 单世华 孔令让

摘要：为明确抗感黄曲霉花生种质的遗传多样性和亲缘关系，发掘优良抗性种质，本研究利用46对多态性SSR引物分析48份抗感黄曲霉或相关花生种质的遗传多样性，平均每对引物可扩增出5.15个等位变异，平均PIC值为0.604；聚类分析将48份种质分为8组，其中抗性种质被分成5组；低产毒种质91048、抗侵染种质AR-3、PI337409F和GFA-2以及抗圆柱状黑腐病种质PERRY与其它种质存在较大的遗传差异，可作为理想的育种材料；抽取5个标记共35个多态位点建立了48份抗感黄曲霉或相关花生种质的“引物+0，l字符串”计算机化的DNA指纹图谱。筛选出的优异种质可在抗黄曲霉品种培育中作亲本利用，以拓宽其遗传基础。

关键词：抗黄曲霉；遗传多样性；聚类分析；指纹图谱

中图分类号：S565.202.4

文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）01-0001-06

花生（Arachis hOpogaea L.）是重要的油料和经济作物，是众多发展中国家主要的油脂和蛋白质来源，但同时花生也是易受黄曲霉毒素污染的农作物之一。黄曲霉毒素（Aflatoxin）是一种强致癌生物毒素，它对花生及其加工产品的污染已成为影响农产品质量和食品安全的主要问题之一，严重威胁人类健康，制约全球花生产业的持续发展。

花生对黄曲霉毒素污染的抗性主要有两种类型，即抗侵染和抗产毒。抗侵染的种质较多，从1973年开始，先后筛选出J11、P1337394F、P1337409、GFA-l、GFA-2、AR-1、AR-2、AR-3、AR-4、ACC63、CES48-30等近40份高抗、中抗种质，黄曲霉菌在这类花生种质上很难侵染和定殖，这是一种基于种皮结构及生化成分的抗性。抗产毒种质相对较少，只有4份，分别为抗黄曲霉产毒种质US26和低产毒花生品种Tifton-8、91322、91048，这类种质在黄曲霉菌侵染后可抑制毒素产生，该抗性与花生的种皮及胚有关系。花生对黄曲霉菌的侵染抗性和产毒抗性都具有降低黄曲霉毒素污染的作用。前人研究表明，抗侵染和抗产毒由相对独立的抗性基因所控制，通过分子育种聚合多个抗病基因是解决花生黄曲霉毒素污染最为经济有效的手段。

明确抗病资源的遗传多样性和亲缘关系，发掘优良抗性种质，是培育抗病品种的基础。但是，由于黄曲霉毒素污染问题的复杂性，尤其是缺乏经济有效的抗性鉴定方法，导致花生抗性育种研究进展缓慢。因此，有必要采用新的技术对花生黄曲霉抗性进行筛选和鉴定，增强抗性鉴定结果的重复性、可靠性。分子标记技术的发展为花生抗黄曲霉育种提供了有力的研究手段。Hong等（2009）鉴定到5个和花生抗黄曲霉侵染高度相关的SSR标记，其中的标记pPGSseq19D9能区分所有的抗感品种；进而获得了与包括百果重、含油量、蛋白含量、成熟荚果数、分枝数等11个表型性状相关的特异DNA标记；还筛选到与控制种皮颜色的基因紧密连锁的SSR标记PM93，二者的遗传距离为5.4cM。本研究利用多态性SSR标记构建抗感黄曲霉及相关种质的指纹图谱，鉴定抗性种质在分子水平的遗传特征，为花生品种改良提供丰富的抗源材料，拓宽花生抗性育种的遗传基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用国内外已鉴定并确认的48份抗感黄曲霉及相关花生种质（包括7份抗其它真菌和2份抗旱种质，见表1）为材料，每份材料选取3粒种子，水培至三片真叶出现，每株取一片小叶混合后加液氮研磨，CTAB法提取基因组DNA，稀释至30ng/μL备用。

1.2 SSR标记检测

利用前期已筛选的46对多态性高、条带单一的多态性引物，分析48份抗感黄曲霉及相关花生种质的遗传多样性。10μL SSR-PCR反应体系包括1.5μL DNA，1.9μL ddH₂O，5μL2×Frements Mix，引物（10U）各0.8μL。反应程序为：95 qC预变性3 min；95qC变性45 s，55 qC退火45s，72℃延伸45s，35个循环；最后720C延伸5min。利用C1000 TouchrrM PCR仪（美国Bio-Rad公司）进行扩增。6%聚丙烯酰胺凝胶（29∶1）电泳在JY-JX5垂直电泳槽（北京君意东方仪器设备有限公司）上进行，1×TBE作电泳缓冲液，每孔加入PCR扩增产物2μL，电压为200V，电泳时间根据片段大小确定。电泳结束后，银染并显影，白炽灯背景下拍照并保存。

1.3 数据统计方法

PCR扩增产物电泳结果以“0，1”方式统计，即在相同迁移位置上，有带的赋值为1，无带赋值为0，建立“0，1”数据阵。多态性信息含量（PIC）是表示微卫星序列变异程度高低的指标。式中，Pi、pj分别为群体中某SSR分子标记位点第i、j个等位变异的频率，n为等位变异数。

2 结果与分析

2.1 SSR标记的遗传多态性

46对SSR引物在48份材料中共扩增出237个等位变异，等位变异的范围为2～8；等位变异数最多的SSR引物是AhITC2A02和AhlTC5D06，有8个；等位变异数最少的SSR引物是GM2165，只有2个；平均每对引物可扩增出5. 15个等位变异。PIC值为0.337～0.812，最高的是PM308，最低的是GM2165，平均PIC值为0.604（表2）。图1、图2为其中两对SSR引物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。

46个SSR分子标记分布于23个不同的连锁群上，LG13、LG14、LG19等1 1个连锁群上分别只有1个，最多的LG6上分布有7个，其余有2～5个不等。不同连锁群上SSR标记等位变异数不同，最少的LG21为3个，最多的LG6为34个。不同连锁群SSR标记的平均多态性信息含量也不同，LG5连锁群位点平均PIC最小，为0.419；LG9连锁群位点平均PIC最大，为0.774（表2）。

2.2 48份抗感黄曲霉及相关花生种质的聚类分析

根据“0，1”数据构建48份花生种质的遗传距离矩阵，利用“SHAN”进行聚类分析。结果表明，在遗传距离为1.05处，48份种质被分成了8组（图3）。其中91048为低产毒种质，与其它种质距离较远，最先被分出来，单独成一组；AR-1、AR-2中抗黄曲霉侵染种质为第二组；红膜七十日早、蒲庙花生和石龙红花生3份不抗旱种质为第三组；抗旱种质赣榆小站秧和万安花生聚为第四组；低产毒的91322和抗黄曲霉侵染的新会小粒、ICGV94433、ICGV94434、ICGV87094、ICGV95440、ICGV94379以及ICGV92243聚为第五组；PI337409F单独为第六组；抗黄曲霉侵染的AR-4、湛秋48和GFA-2，低产毒的US26、Tifton-8，抗其它真菌病害的Tiffrun-ner、CIl-2-39、C209-6-60、C724-25-22、C156-47、C76-16，抗圆柱状黑腐病的PERRY以及感病种质泉花10号、香乡聚为第七组，在遗传距离为0.724处可以将抗黄曲霉相关种质AR -4、US26、Tifton-8（ A）与抗其它真菌病害的Tiffrunner等6个种质（B）以及国内种质（C）各自分组，并可将PERRY（E）和GFA-2（D）分别独立出来；高感黄曲霉污染的金花1012、白沙1016、粤油92、瑶上大麻壳、茶杵豆与抗黄曲霉侵染种质AR-3、Celebes、CES48-30、GFA-1、J11、AH7223、UF71533-1、ICGV94435、PI337409、ICGV95435、ICGV95422、ICGV87110聚为第八组，在0.935处，可将抗感（H）种质完全分开，在0.916处，又可以将中抗黄曲霉侵染的AR-3（F）与其他高抗种质（G）分开。从以上分组可以看出，具有相同抗性特点的大部分种质都聚为一类，表明这些种质的遗传背景是很相似的。

2.3 48份抗感黄曲霉及相关花生种质的指纹图谱构建

从46个SSR标记中抽取5个标记共35个多态位点，可以将48份花生种质完全区分开来。这5个SSR标记分别为：AhlTC2A02（A）、AhlTC5D06（B）、STS20（C）、GNB556（D）和S093（E）。将35个多态性位点依次排序，把扩增产物的有无分别记为“l”和“0”，则可建立48份花生种质的计算机化的DNA指纹图谱（表3）。

3 讨论与结论

3.1 SSR标记在评价花生遗传多样性中的高效性

SSR分子标记具有高丰度、高多态性、共显性遗传、结果稳定、检测技术简单等特点，应用多态性SSR标记对具有优异基因种质的遗传多样性及其亲缘关系进行评价，可以为抗病虫、抗逆以及优质基因的精细定位及分子标记辅助选择等研究奠定基础。

本试验采用46对多态性SSR引物进行扩增，平均每对引物可扩增出5.15个等位变异，平均PIC值为0.604，聚类结果与抗感黄曲霉花生种质的来源、抗性特点及遗传背景非常一致，证明SSR标记是一种可靠的标记类型。聚类分析将AR-3、GFA-2、PERRY、PI337409F和91048分别独立出来，说明这5个种质与其它种质存在较大的遗传差异，可作为理想的育种材料，尤其是AR-3、GFA-2和PERRY株型较直立，果仁大而饱满，符合高产优质这一当前育种要求，可作为杂交育种的亲本，拓宽花生抗黄曲霉育种的遗传基础，实现种质的创新。

3.2 品种指纹图谱

品种的指纹图谱可以看作是该品种的“身份证”，将品种、引物名称、分子数据等有序地整合在一起，形成每个品种唯一的识别代码。SSR引物检测到的位点相对较少，且特异性强，谱带清晰，数据准确，适用于大量品种的鉴定分析。赵新燕等利用46对SSR引物构建了20份高油野生花生的数字分子指纹，选用了3组代码，分别为国家统一编号、有效引物名称、“0，1”字符串，通过这些DNA指纹图谱，可以有效鉴定区分所有供试材料。刘冠明等应用SSR标记构建了20个南方花生主产区品种的指纹图谱，仅用4对引物即可将19个品种相互区分开。王燕龙用23对SSR标记构建了144个花生栽培种的指纹图谱，所用代码为“引物代码+十六进制字符串”。本试验从46对SSR中抽取由5对标记所产生的35个多态位点，将48个抗感黄曲霉花生种质区分开来，建立了抗感病花生种质的“引物+0，l字符串”的指纹图谱，为抗感黄曲霉花生种质资源的有效利用提供指导。