利用SSR标记鉴定花生杂交F₁代真假杂种

曹广英 吴琪 王云云 张青云 王秀贞 唐月异 孙全喜 王传堂 关淑艳

摘要：以抗青枯病花生品种日花l号、山东省花生研究所选育的高油酸花生品种花育662和高产大花生品种花育9610为亲本正、反交获得的F1代种子为材料，利用微卫星（SSR）标记技术鉴定真杂种；从候选的50对SSR引物中筛选得到在亲本中有稳定、清晰多态性位点的引物5对，对杂种F1代进行鉴定。结果表明，四个杂交组合共鉴定出30粒真杂种，并得到形态学鉴定结果的确认。

关键词：花生；SSR；杂种鉴定

中图分类号：S565.203.7

文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）01-0007-05

花生（Araclzis hypogaea L.）是我国重要的油料和经济作物，在国计民生中占有举足轻重的地位，故一直以来花生的遗传育种工作都受到高度重视。目前，利用具有优良性状的育成品种进行杂交选育花生新品种，仍是最常用、最有效的育种方法。随着分子生物学、花生基因组学以及生物信息学的发展，分子标记技术在辅助花生育种中的作用也不断体现出来，尤其是对杂种F1代的鉴定工作，而这也是杂交育种的关键问题之一。传统的鉴定工作一般是根据父、母本的形态学特征进行判断，但由于高产育种中父母本的趋同性越来越强，通过形态学鉴定不仅周期长而且可靠性差，而分子标记辅助鉴定的方法能够准确、方便、快捷地鉴定F1代种子真伪，不必等到F1代长成植株再作判断。SSR（Simple SequenceRepeat）标记具有在基因组中分布广泛、多态性高、共显性、检测程序简单等诸多优点，被广泛应用于花生育种工作。

本研究利用SSR标记鉴定四个花生杂交组合的F1代种子，建立基于SSR的花生杂种鉴定技术体系，以期为后续育种工作提供鉴定技术参考。

1 材料与方法

1.1供试材料

本试验以抗青枯病北方大花生栽培品种日花1号、山东省花生研究所选育的高油酸花生品种花育662和高产大花生品种花育9610正、反交F1代群体为材料。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA提取 基因组DNA提取采用SDS抽提法。用刀片切一薄片花生子叶0.19加入1.5mL离心管中，加入0.2mL SDS提取液（0.01mol/LTris-HCl，0.1% SDS），用研磨棒研磨，55℃水浴30min，后加入酚：氯仿：异戊醇（25∶24∶1）溶液0.2 mL充分混匀，12000r/min离心10min，取上清，加入等体积的异丙醇，12000r/min离心10min，沉淀用70%乙醇漂洗，风干后溶于50μL TE缓冲液，保存在-20℃冰箱备用。

1.2.2 SSR标记筛选 从公开发表的文献中选取50对SSR引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。利用这50对SSR引物对父、母本进行多态性分析，选择条带清晰、稳定、有明显差异的标记用于F1代杂种鉴定。

1.2.3 F1代杂种鉴定 以杂种Fi代种子DNA为模板，使用筛选出的SSR标记进行PCR扩增，同时具有父母本扩增带型的样品为真杂种。

PCR反应体系（20μL）为：2×Taq PCR Mas-ter Mix（DBI Bioscience）10μL，正、反向SSR引物（10μmol/L）各0.5μL， ddHO8₂μL， 30ng/μLDNA模板1.0μL。反应程序为：94qC预变性5min；94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸2miii，35个循环；72℃再延伸5min，4℃保存。PCR产物用6%聚丙烯酰胺变性凝胶电泳检测，银染显色并拍照存档。

1.2.4 叶片形态鉴定 将上述鉴定出的真杂种和父、母本播种于大田中，待植株长至70天左右，取主茎自上向下第三片真叶进行叶片形态比较。

2 结果与分析

2.1 亲本间SSR多态性标记筛选

利用50对SSR引物对亲本日花1号、花育662和花育9610进行多态性分析，筛选出5对多态性好的引物（表1），用于F1代杂种鉴定。

2.2 F1真假杂种鉴定

用筛选出的引物检测4个杂交组合的146粒F1代种子，每个杂交组合用两对SSR引物相互验证，结果共鉴定出30个真杂交种（表2）。F1代真杂种同时具有父本和母本双方的谱带，呈共显性，而假杂种只有母本的条带（图1～6）。

2.3 叶片形态鉴定

亲本日花1号叶片呈长椭圆形，叶片最宽的部位在叶片纵轴的二分之一处。花育662叶片呈椭圆形，叶片最宽处在叶片纵轴的三分之一处，叶纵轴最远处略呈尖端。花育9610叶片呈倒卵形，叶片最宽处在叶片纵轴的三分之一处，叶纵轴最远处略圆。第1个和第3个杂交组合皆是以日花1号为母本，但其F1代叶片与母本差别较大，形状比母本叶片短，叶色也较母本深，叶片形状更倾向于父本叶片（图7A和图7C）。同样，第2个和第4个杂交组合中F1代叶片较母本变长，叶片纵轴远端变尖，包含了父本叶片的形态特征（图7B和图7D）。试验结果表明，真杂种叶片均包含有父本叶片性状，与SSR鉴定结果一致。

3 讨论与结论

传统的真假杂种鉴定一般采用形态标记进行，往往鉴定周期长，容易受外界环境因素影响，存在较大的误差，一些性状差异小的品种鉴定往往比较困难。而DNA分子标记反映的是遗传本质上的差异，能够从分子水平准确快速地鉴定品种真实性，用于杂种鉴定时周期短且不受环境条件的影响，结果真实可靠。目前DNA分子标记已广泛应用于花生杂种鉴定研究中。SSR标记技术具有简便、多态性高、能检测出微小变异等优点，是进行花生杂交种鉴定的理想标记。本试验利用SSR标记技术鉴定花生四个杂交组合F1代中的真杂种，每一个组合都使用两对SSR引物进行鉴定，相互印证，保证了结果的准确性。田间植株叶片形态检验结果表明，子代叶片都包含有父本叶片性状，与分子鉴定结果一致。因此，利用SSR分子标记进行花生真假杂种鉴定是可行的。