TDZ和BA对金花梨和鸭梨叶片不定芽再生的影响

孙洪雁 陶吉寒 辛力 孙清荣

摘要：为了提高金花梨和鸭梨2个品种叶片不定芽再生能力，以其试管苗叶片为外植体，以NN69为基本培养基，研究了不同浓度TDZ和BA对2个品种梨叶片不定芽再生的影响。结果表明：BA对鸭梨叶片不定芽的再生比TDZ有效，TDZ未能诱导鸭梨叶片产生不定芽；BA对金花梨叶片不定芽再生率的影响与TDZ无显著差异，但TDZ比BA显著提高了金花梨叶片的平均每叶不定芽数。

关键词：梨；叶片；植物生长调节剂；不定芽再生；TDZ；BA

中图分类号：S661.204⁺.3

文献标识号：A

文章编号：1001-4942（2016）01-0026-04

梨是我国第三大果树，其种植面积和产量仅次于苹果和柑桔。梨果也是世界范围内深受消费者喜爱的水果之一。但梨树生长过程中经常受到一些病害的威胁。传统的杂交育种虽然可以进行有利性状包括抗病性状的转移，但由于梨树具有高度杂合的遗传背景和较长的童期，采用杂交育种方法进行抗性选择不仅难度较大，而且需时长。果树的自然芽变，虽然可以出现果实大小、果皮颜色、株型等的变异，但很难出现抗性突变变异。基因工程的外源基因遗传转化操作为植物的抗病性改良提供了新的育种方法，并在多种植物上获得了成功，但遗传转化操作成功应用于果树的前提是离体叶片高效不定芽再生体系的建立。离体叶片不定芽再生体系的建立还可用于体细胞诱变研究及无性变异选择研究。关于梨树叶片不定芽再生的研究已在很多品种上获得了成功，但不同基因型不定芽再生的难易及再生频率不同。而一个品种离体叶片不定芽再生的高效性应该是既有高的再生频率又有高的单位叶片不定梢数，这是应用遗传转化操作技术改良品种的理想的前提条件。本试验通过研究不同浓度TDZ和BA对金花梨和鸭梨叶片不定芽再生的影响，旨在提高2个品种梨离体叶片的不定芽再生力，为利用体细胞诱变方法及外源基因转化操作改良品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1试验材料

试验材料为本实验室继代保存的金花梨和鸭梨的试管苗。

1.2试验方法

试管苗继代增殖培养3～4周时，取绿梢顶部2～3片刚展开的幼嫩叶片，用无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切，叶缘不切断以保证叶片完整，把带有切口的叶片接种于装有不定芽诱导培养基的三角瓶内。每个处理接种3瓶，每瓶接种10片，重复3次。叶片接种后先置于黑暗条件下暗培养3周，然后转移至光培养条件下培养。培养至6周时，观察和统计产生不定芽的叶片数，记录每个叶片产生的不定芽数，计算不定芽再生率和平均每叶不定芽数。不定芽再生率（%）=产生不定芽的叶片数/接种总叶片数×100；平均每叶不定芽数=不定芽总数/产生不定芽的叶片数。再生力=不定芽再生率（%）×平均每叶不定芽数×100。

不定芽诱导培养基：以NN69为基本培养基，分别添加不同浓度的BA（3、5mg/L）或TDZ（1、2mg/L），共设4个处理，每个处理均添加0.3mg/LIBA、30g/L蔗糖、6g/L琼脂，灭菌前pH值调节为5.8。

培养条件：光培养的光周期为16h光/8h暗，光强为40μmol·m-2^-2·S^-1，培养温度为（25±+2）℃。

1.3 数据统计分析

试验数据采用DPS 7.5软件进行统计分析，不同处理平均值用LSD法进行差异比较分析。

2 结果与分析

2.1 TDZ和BA对金花梨叶片不定芽再生的影响

由表l可知，添加不同浓度TDZ和BA的培养基均能成功诱导金花梨叶片产生不定芽（图1A、B），各处理对不定芽再生率的影响无显著差异，均可达80%以上。其中，1mg/L TDZ处理显著提高了金花梨的平均每叶不定芽数，与其他处理间差异显著，且再生力最高，为539.88。由此可见，TDZ对诱导金花梨叶片不定芽再生比BA更有效。

2.2 TDZ和BA对鸭梨叶片不定芽再生的影响

由表1可知，添加不同浓度BA的培养基均可成功诱导鸭梨叶片产生不定芽（图1C），其中，3mg/L BA处理的不定芽再生率显著高于5mg/LBA的处理，且再生力明显较高；5mg/L BA处理的平均每叶不定芽数略高于3mg/L BA处理，但差异不显著。添加TDZ的培养基未能诱导鸭梨叶片产生不定芽，只能诱导叶片伤口处产生愈伤（图ID）。表明BA对诱导鸭梨叶片不定芽再生比TDZ有效，且较低浓度的BA更有利于诱导鸭梨叶片不定芽再生。

2.3 TDZ和BA对不定芽伸长生长的影响

BA诱导产生的不定芽，在不定芽诱导培养基上可直接伸长生长形成不定芽绿苗（图1B、C），2个品种结果表现一致；TDZ诱导产生的不定芽，在不定芽诱导培养基上不能直接伸长生长形成不定芽（图1A），转移至添加1mg/L BA的MS培养基上可获得正常伸长生长的不定芽绿苗。

2.4 不定芽的增殖和生根培养

获得的不定芽转移到增殖培养基MS+1mg/LBA+0.2mg/LIBA上进行继代增殖培养，2个品种均获得了良好的增殖生长和伸长生长。

继代伸长生长的绿苗在生根培养基1/4MS（MS大量元素的1/4）+0.5mg/L IBA上，2个品种均获得了85%以上的生根率。

3 结论与讨论

TDZ和BA对不同基因型梨叶片不定芽再生的影响不同。Caboni等研究表明BA对野生梨叶片不定芽再生的影响比TDZ更有效。Liu等研究表明TDZ对‘中梨1号叶片不定芽再生的诱导比BA更有效。本研究结果表明，TDZ对金花梨叶片不定芽再生的诱导比BA更有效，且明显提高了不定芽再生力；而BA对鸭梨叶片不定芽再生的影响比TDZ更有效，且BA诱导叶片不定芽再生率可达55%，而TDZ未能诱导鸭梨叶片产生不定芽。

在木本植物的组织培养中，TDZ是一种活性很强的类细胞分裂素物质，虽能有效诱导不定芽再生，但又常存在着抑制不定芽伸长生长的作用。本研究中，对金花梨叶片不定芽再生的试验也表现为TDZ抑制不定芽的伸长，这与前人研究结果一致。鸭梨在BA培养基上可直接获得伸长的不定芽，但鸭梨的不定芽再生力较低，提高鸭梨叶片不定芽再生率的研究正在进一步试验中。