不同灌注方式对大鼠小体积肝移植生存率的影响

杨超，张雅敏，崔子林，刘子荣，史源，沈中阳



不同灌注方式对大鼠小体积肝移植生存率的影响

杨超1，张雅敏2△，崔子林2，刘子荣1，史源2，沈中阳2

摘要：目的探讨不同的灌注方式对大鼠小体积肝移植生存率的影响。方法将156只SD大鼠随机分为经门静脉灌注组（GroupⅠ）和经腹主动脉灌注组（GroupⅡ），每组78只，供、受体各39只。GroupⅠ与GroupⅡ在获取供肝后，切除肝脏的左叶和中叶，剩余约30%体积进行移植，术中记录供体和受体的体质量、移植肝质量、温缺血时间、供体手术时间、冷缺血时间、无肝期、肝下下腔静脉阻断时间及受体手术时间相关指标，比较2组大鼠术后6 h、1 d、3 d和7 d的血清丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平、病理HE染色及7 d生存率。结果2组术中血清ALT、AST均逐渐下降，但是GroupⅠ下降缓慢，术后24 h高于GroupⅡ（P＜0.05）。HE染色提示GroupⅠ术后早期肝组织显微结构损伤大，GroupⅠ的7 d中位生存期低于GroupⅡ（Log-rank χ2=4.050，P=0.044）。结论使用经腹主动脉灌注的方法建立大鼠小体积肝移植模型具有肝脏损伤小、生存率高的优势。

关键词：肝移植；大鼠，Sprague-Dawley；小体积肝移植；灌注方式

△通迅作者E-mail：zhangyamin@medmail.com.cn

活体肝移植与劈离式肝移植是缓解供肝短缺的有效方法，然而如果有效肝体积不足往往会造成小肝综合征，预后很差。大鼠小体积肝移植模型是研究小肝综合征的理想平台，但该模型成活率低[1-2]，诸多学者通过改良手术方法来进一步提高成活率[3-4]，其中供肝的灌注是影响供肝质量的一个重要因素，常见的灌注方式为经门静脉灌注与经腹主动脉灌注。本研究旨在探讨不同的供肝灌注方式是否会影响大鼠小体积肝移植术后生存情况。

1　材料与方法

1.1材料器械使用常规显微外科手术器械，门静脉、肝下下腔静脉套管分别选用外径为2.4 mm和3.2 mm的聚乙烯管，胆管支架采用硬膜外管。使用腹腔注射的方法进行麻醉，麻醉剂使用水合氯醛溶液。

1.2实验动物及分组体质量约220～280 g的健康清洁级雄性SD大鼠156只。大鼠饲养在12 h昼夜交替环境中，自由进食饮水。随机分为2组，GroupⅠ及GroupⅡ，每组78只，供、受体各39只。具体分组方法为：将体质量相同或相近的2只大鼠配为1对，每对编号1和2，从随机数字表中连续记录78个数字，如为奇数，则该对1号进入GroupⅠ，2号进入GroupⅡ；如为偶数，则该对1号进入GroupⅡ，2号进入GroupⅠ。在2组中再次使用相同的方法将大鼠分为供体组和受体组。在供肝获取时，GroupⅠ应用经门静脉灌注的方式，GroupⅡ应用经腹主动脉灌注的方式。

1.3手术方法参照Kamada等[5]改良的二袖套法，不重建肝动脉，灌注后在体切除肝叶。GroupⅠ：在脾静脉分支上缘阻断门静脉，迅速用头皮针穿刺门静脉且固定穿刺针。GroupⅡ：分离腹主动脉腹腔干分支上缘，绕腹主动脉穿过4-0丝线备用，分离髂总动脉分支处动脉与静脉，穿线备用。预留丝线结扎腹腔干，阻断髂总动脉分支处腹主动脉，头皮针穿刺腹主动脉。2组均在上述操作后，使用4℃含肝素12.5 U/mL的乳酸林格钠溶液灌注肝脏，灌注量约10 mL，灌注速度为2 mL/min，剪断肝下下腔静脉，剪开膈肌并切断上腔静脉，同时以4℃生理盐水泼洒肝脏表面。

1.4数据收集术中记录供、受体体质量、移植肝质量、温缺血时间、供体手术时间、冷缺血时间、无肝期、肝下下腔静脉阻断时间及受体手术时间相关指标。每组随机抽取术后大鼠15只比较生存率，观察周期为7 d。再分别于术后6 h、1 d、3 d、7 d每组各处死6只大鼠，取血，检测丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）。取移植肝右上叶肝组织，甲醛固定，常规石蜡包埋，切片，用于HE染色。

1.5统计学方法所有统计数据均采用SPSS 19.0统计软件分析。计量资料以x ±s表示，正态分布计量资料2组比较采用t检验；非正态分布计量资料2组比较采用非参数秩和检验；计数资料以例（%）表示，2组间比较采用χ2检验。生存率比较使用Log-rank法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1 2组术中相关指标比较2组各记录指标比较差异均无统计学意义，见表1。

2.2肝功能情况在术后6 h时GroupⅠ与GroupⅡ的血清ALT明显升高；24 h持续较高水平，但GroupⅡ已经开始下降，与GroupⅠ比较差异有统计学意义（t=2.968，P＜0.05）；以后ALT水平逐渐下降，至术后7 d时基本恢复正常。血清AST表现出了与ALT的类似趋势，在术后24 h GroupⅡ血清AST水平明显低于GroupⅠ（t=2.806，P＜0.05），见图1、2。

2.3肝组织病理大鼠术后6 h GroupⅠ可见肝窦明显扩张，肝窦内皮细胞分离，肝细胞核染色数目明显少于GroupⅡ，许多肝细胞其细胞核并未染色。而GroupⅡ在术后6 h肝窦间隙正常，肝窦内皮细胞完整，肝细胞轻度肿胀，见图3。

Tab. 1 Comparison of the related data in operation between two groups表1　2组手术相关数据比较（n=39，±s）

Tab. 1 Comparison of the related data in operation between two groups表1　2组手术相关数据比较（n=39，±s）

组别GroupⅠGroupⅡt组别GroupⅠGroupⅡt组别GroupⅠGroupⅡt供体质量(g) 244.95±14.87 247.93±14.45 0.865温缺血时间(s) 32.04±3.01 30.66±3.21 1.961无肝期(min) 20.33±1.63 20.25±1.37 0.231受体质量(g) 244.85±16.50 248.88±14.45 1.147供体手术时间(min) 43.00±6.63 40.99±6.88 1.318肝下下腔静脉阻断时间(min) 27.99±2.62 27.09±2.12 1.647移植肝质量(g) 3.12±0.28 3.03±0.27 1.499冷缺血时间(min) 81.83±10.06 79.51±8.93 1.077受体手术时间(min) 78.73±6.93 79.77±8.75 0.585

Fig. 1 The serum ALT levels of both groups after liver transplantation图1　不同时间点血清ALT值

Fig. 2 The serum AST levels of both groups after liver transplantation图2　不同时间点血清AST值

Fig. 3 Hematoxylin and eosin staining at 6 h after reperfusion（HE,×400）图3　术后6 h两组大鼠肝脏切片（HE，×400）

2.4生存分析GroupⅠ的7 d生存率为20.00%（3/ 15），中位生存期为2 d，GroupⅡ的7 d生存率53.33%（8/15），中位生存期大于7 d，两者中位生存期差异有统计学意义（Log-rank χ2=4.050，P=0.044），见图4。

Fig. 4 Seven-day survival curves of both groups图4　2组大鼠7 d生存曲线

3　讨论

目前很多学者研究通过不同干预措施来提高小体积肝移植大鼠的成活率[6-8]，也有学者通过提高供肝质量进行改良[3]。大鼠肝移植可以不重建肝动脉，因此直接从门静脉灌注的方法最为普遍。而另一种灌注方法是经腹主动脉灌注，其操作相对复杂，灌注时间长，但是由于实现双重灌注[9]，即同时灌注肝动脉及门静脉，从而使供肝彻底灌注，因此这种灌注方式也越来越多地被应用于供肝获取。有研究表明，在大鼠全肝移植时，经门静脉灌注与经腹主动脉灌注获得的供肝，在移植后生存率并未表现出明显差异[10]。但在大鼠小体积肝移植模型中却很少有相关报道。本研究设计了在相同灌注条件下，不同的灌注方式获得的供肝对大鼠小体积肝移植术后生存情况的影响。

两种灌注方式术后结果比较，在肝损伤方面，2组大鼠术后ALT、AST水平均显著升高，随后逐渐降低。在术后24 h，经腹主动脉灌注组的血清ALT、AST水平下降明显。观察术后6 h大鼠肝脏组织HE染色结果，通过两种灌注方式的比较，经门脉灌注的肝脏可见肝窦明显扩张，肝窦内皮细胞分离，肝细胞核染色数目明显减少，提示经门静脉灌注的小体积肝脏，恢复血流灌注后损伤较严重。分析原因，大鼠小体积肝移植术后血流动力学变化较大，门脉压力显著增高[1]，肝脏显微结构发生变化[11]，进而影响肝功能的恢复及肝再生[2]。适当的灌注压力与灌注速度是获得良好供肝的保障[12-13]，经腹主动脉灌注可能会有更符合生理的灌注压力与灌注速度，提高了供肝质量，减轻了缺血再灌注损伤。

然而，腹主动脉灌注肝脏也有缺点，相对门静脉灌注方法，前者操作相对复杂，需要游离腹主动脉的腹腔干上缘，在灌注前将其阻断，防止灌注液的逆流，同时分离髂总动脉分支上缘动脉，后者作为灌注穿刺的部位。本研究在使用腹主动脉灌注方法时，并未完全分离腹腔干，只是游离腹腔干上缘，穿引丝线。当灌注时，直接结扎丝线。在分离穿刺点时，不必单独分离动静脉，直接联合分离，挂线备用。以上步骤既缩短了灌注穿刺时间，又减少了出血的可能。通过上述改良操作及熟练的手术技术，本研究中供体手术时间在两组中未见明显差异。此外，腹主动脉灌注需要清除肠道的血液，可能会增加温缺血时间。为了缩短温缺血时间，在灌注前结扎脾静脉，减少脾脏血液回流至门静脉，而且在灌注开始后，用4℃生理盐水不断泼洒肝脏表面，使其迅速降温，并采用腹腔中放置碎冰，保证肝脏周围环境处于较低温状态。通过上述操作，本研究中2组的温缺血时间并未表现出明显差异。

本研究发现，建立大鼠小体积肝移植模型时，在灌注条件相同的情况下，相比于门静脉灌注，经腹主动脉灌注方式术后具有肝脏损伤小、中位生存期高的优势，可被作为大鼠小体积肝移植的首选，但是对于经腹主动脉灌注的最适宜流速及相应的分子生物学机制还有待进一步的研究。

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（2015-08-25收稿2015-10-18修回）

（本文编辑魏杰）

作者单位：1天津医科大学一中心临床医学院（邮编300192）；2天津市第一中心医院

Impact of different ways of perfusion on the survival rate of small-for-size liver transplantation in rats

YANG Chao1, ZHANG Yamin2△, CUI Zilin2, LIU Zirong1, SHI Yuan2, SHEN Zhongyang2
1 First Center Clinical Institute, Tianjin Medical University, Tianjin 300192, China; 2 Tianjin First Center Hospital
△Corresponding Author E-mail: zhangyamin@medmail.com.cn

Abstract:Objective To investigate the effects of different hepatic perfusion procedures for small-for-size liver transplantation in rats. Methods A total of 156 rats were randomly divided into two groups: portal vein perfusion group (groupⅠ, n=78) and abdominal aorta perfusion group (groupⅡ, n=78). After harvesting graft, the left lobe of the liver and the middle lobe were resected and the remaining approximately 30% volumes of the liver were transplanted in groupⅠand groupⅡ. The body weights of donor and acceptor, the weight of graft, the time of operating in donor, the cold ischemia time, anhepatic phase, the blocking time of inferior hepatic vena cava and the time of operating in receptor were recorded in two groups. The serum levels of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), pathological HE staining and 7-day survival rate in 6 h, 1 d, 3 d and 7 d after operation were compared between two groups. Results The serum levels of ALT and AST were decreased gradually in two groups, but the levels decreased slowly in groupⅠ. The serum levels of ALT and AST were significantly higher in groupⅠthan those of groupⅡ(P＜0.05). HE staining showed greater damage of mi⁃crostructure of liver tissue at early stage in groupⅠthan that in groupⅡ. The 7-day survival rate was lower in groupⅠthan that of groupⅡ(χ2=4.050，P=0.044). ConclusionThere is a higher survival rate and mild liver damage in small-forsize liver transplantation in rats using perfusion by abdominal aorta.

Key words:liver transplantation; rats, Sprague-Dawley; small for size liver transplantation; perfusion

中图分类号：R657.3

文献标志码：A

DOI：10.11958/20150129

基金项目：国家自然科学基金面上项目(81370576)；天津市应用基础与前沿技术研究计划(14JCYBJC24800)

作者简介：杨超（1988），男，硕士在读，主要从事大鼠小体积肝移植研究