甘蓝型油菜萝卜质雄性不育恢复系R2572的分子标记研究

杨其东，席　坤，董军刚，张　博，许　婷，董振生

(西北农林科技大学 农学院，陕西 杨凌 712100)



甘蓝型油菜萝卜质雄性不育恢复系R2572的分子标记研究

杨其东，席坤，董军刚，张博，许婷，董振生

(西北农林科技大学 农学院，陕西 杨凌 712100)

[摘要]【目的】 对甘蓝型油菜萝卜质雄性不育系的18个恢复材料进行恢复基因Rfo及其旁侧特异性标记研究，以便筛选出与国外同类恢复材料具有差异的恢复系。【方法】 以18个甘蓝型油菜萝卜质雄性不育恢复系为材料，选择1个Rfo特异性分子标记、5个与Rfo紧密连锁的标记以及先锋国际良种公司关于芸薹属Ogura恢复系专利鉴定的特异性标记对所选恢复材料进行分子检测，根据检测结果与国内外同类恢复材料(RRH1、R113、R211、R2000、CLR650、SRF系、NW1717)进行对比鉴定。【结果】 18个萝卜质雄性不育恢复材料均含有恢复基因Rfo，各恢复系缺少了R113、R211，R2000共有的标记E33M47、E32M50、OPN20、OPH15、IN6RS4、E33M58、BolJon、ScH03，同时多了一个R211、R2000、CLR650共有的标记PGlint。各恢复系含有和NW1717相同的标记。【结论】 R2572可能与RRH1、R113、R211、R2000、CLR650，SRF系是不同的，而与导入NW1717的萝卜片段长短较为接近。

[关键词]甘蓝型油菜；萝卜质雄性不育系；恢复系；萝卜片段；分子标记

利用细胞质雄性不育、三系配套生产杂交油菜是提高油菜产量与品质的最重要途径之一，这就要求不育系的育性稳定且恢复系恢复育性的能力强[1]。目前国内外报道的甘蓝型油菜细胞质雄性不育系主要有波里马细胞质不育系(Polima CMS)、陕2A细胞质不育系(Shan 2A CMS)、Nas 细胞质不育系(Nas CMS)、萝卜细胞质不育系(Ogura CMS)[2-3]。其中主要应用的CMS系统是Polima CMS和Shan 2A CMS，但Polima CMS和Shan 2A CMS均存在温度敏感现象，在开花前遇到低温条件会恢复育性产生微粉，影响杂交种的纯度。

Ogura CMS首次报道于萝卜资源中[4],其对环境不敏感，不育性稳定彻底，由细胞质中线粒体嵌合基因orf138[5-6]和1对隐性细胞核基因(rfrf)共同控制[7]，被认为是最稳定的不育材料，而且几乎所有的甘蓝型油菜都可以很好地保持其不育性，因此是选育双低一高油菜不育系的首选途径。但Ogura CMS恢复系筛选非常困难，Nieuwhof(1990年)与Bonnet(1997年)在欧洲的萝卜品种中发现了Ogura CMS的恢复基因Rfo，Desloire等[6]利用图位克隆的方法将恢复基因定位在1个15 kb的DNA片段上，但到目前为止并未在芸薹属作物中找到Ogura CMS的恢复基因[8-9]。因此选育甘蓝型油菜的萝卜质雄性不育恢复系就成为Ogura CMS三系利用的重点。早期，Heyn[10]通过种属间杂交将萝卜中的恢复基因导入到甘蓝型油菜中，但该材料对Ogura CMS只能起到部分恢复育性的作用。Pelletier等[11]利用细胞融合技术使甘蓝型油菜材料获得了完全恢复Ogura CMS育性的能力，但导入恢复基因的同时也将高硫苷基因及与恢复系紧密连锁的冗余片段导入甘蓝型油菜[12-14]，导致恢复系农艺性状差[15]，不能用于商业生产。Primard-Brisset等[16]利用伽马射线辐射诱变使DNA片段重组，获得了低硫苷的甘蓝型油菜Ogura CMS恢复系R2000，使Ogura CMS杂交油菜在欧洲广泛运用。先正达股份公司发现，Ogura萝卜的核酸片段在恢复基因座与芥子油基因座之间发生断裂并重新连接的BLR1重组现象,并通过具备该现象的BLR-038与甘蓝型油菜不育系杂交，从后代中选育出农艺性状良好的低硫苷恢复系[17]。美国先锋国际良种公司通过辐射诱变技术选育了具有缩短Raphanus片段(SRF)的新芸薹属Ogura恢复系[18]。Chen等[19]以萝-蓝(Raphanobrassica，2n=58)为供体材料，利用嫁接技术将恢复基因导入甘蓝型油菜，选育出Ogura CMS的恢复系CLR650，其导入的萝卜片段长度比国外同类恢复材料R113短，但该恢复材料的硫苷含量较高，仍需要进一步的改良才能投入生产。由于国外的Ogura CMS恢复材料长期受到相关专利的保护，而国内能够用于商业化生产的同类材料还很少，因此选育新的Ogura CMS恢复系具有十分重要的意义。为此，本研究以18个甘蓝型油菜Ogura CMS恢复系为材料，不育系288和316以及相应的保持系为对照材料，利用分子标记技术验证材料中Rfo基因的有无，并进一步根据国内外同类恢复材料的分子标记检测结果进行初步比较，为选育出不同于国内外同类恢复材料提供依据。

1材料与方法

1.1试验材料

供试材料：18个甘蓝型油菜Ogura CMS 自交恢复系(R2572系)，源自于能够完全恢复Ogura CMS且农艺性状欠佳的恢复系2572(Ogura CMS恢复基因供体)分别与18个农艺性状良好且高含油量的不育系(恢复基因的受体)进行杂交，在F1代中选择可育植株套袋自交并取其花粉对Ogura CMS进行杂交，对可以使Ogura CMS育性恢复的后代进行连续5代的套袋选择，直至后代的可育性状稳定且可以完全恢复Ogura CMS的育性。2个甘蓝型油菜Ogura CMS不育系材料288和316以及相应的保持系作为对照材料。上述材料均由董振生课题组提供。由于缺少受专利保护的Ogura CMS恢复材料，本试验直接采用文献报道[18-19]的RRH1、R113、R211、R2000、CLR650、SRF系、NW1717的分子标记结果作为本研究的分子检测对照。

1.2试验方法

1.2.1总DNA的提取 植株发育到3叶期，田间取油菜幼嫩叶片(1～2片)置于2 mL离心管中放入冰盒带回实验室。将样品叶片置于研钵中并加入液氮用研磨棒迅速研碎，加入2% CTAB 760 μL继续研磨至匀浆，60 ℃水浴50 min(每10 min振荡1次)；加入760 μL氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)，充分振荡后在4 ℃下11 000 r/min离心10 min；将上清液转移至新的1.5 mL离心管中，加入等体积预冷的异丙醇混匀后置于-4 ℃沉淀30 min，11 000 r/min 离心10 min；弃上清液，依次用体积分数95%乙醇、75%乙醇清洗2次，待沉淀物风干后加入80 μL无胺酶水，置于-20 ℃保存备用。

1.2.2分子标记检测参照Hu等[20]的公开引物，选取1个基于Rfo基因设计的特异标记引物(BnRFO-AS2F/BnRFO-AS2R)，选取Primard-Brisset等[16]文献中与Rfo基因连锁的5个(ScH03、ScA14、SG34、BolJon、PGIint)公开标记引物(表1)以及先锋国际良种公司的专利[18]中所列出的与Rfo基因连锁的标记引物对供试材料进行分子检测，检测结果与Chen等[19]和先锋国际良种公司专利中的分子标记结果(RRH1、R113、R211、R2000、CLR650、SRF系、NW1717)进行比较。PCR反应体系：模板DNA(80～100 ng/μL)0.6 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，Reaction ES Mix(购自康为世纪生物科技有限公司) 5.0 μL，加无胺酶水至10 μL。PCR循环参数：预变性94 ℃ 1 min；变性94 ℃ 30 s，退火56.5 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 30 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min，然后4 ℃保存。电泳检验：将扩增产物置于2.5%的琼脂糖凝胶中，在1%TAE缓冲液中120 V电泳50 min。EB染色20 min，水洗后在凝胶成像系统中进行观察照相。

表 1　Rfo特异性标记及萝卜标记的引物序列

2结果与分析

2.1R2572的Rfo特异性鉴定

选取Hu等[20]报道的Ogura CMS恢复基因Rfo特异性分子标记引物BnRFO-AS2F/BnRFO-AS2R,对恢复系R2572进行检测，结果显示R2572的18个单株均呈阳性反应(图1)，表明所选的18个恢复材料均含有Ogura CMS恢复基因Rfo。

图 1　标记BnRFO-AS2F/BnRFO-AS2R的PCR扩增结果

2.2与恢复基因Rfo连锁的萝卜标记的检测

选取5个与Rfo基因连锁的分子标记ScH03、ScA14、SG34、BolJon、PGIint对恢复系R2572进行分子标记检测，结果表明,标记ScH03在18个恢复系中均呈阴性反应；标记BolJon(图2)在18个恢复系中也呈阴性反应，其中导入甘蓝型油菜中与Rfo连锁的萝卜片段中BolJon标记为600 bp，950 bp源自甘蓝型油菜的C基因组，870 bp源自甘蓝型油菜的A基因组;标记ScA14、SG34、PGIint(图3～5)在18个恢复系中均呈阳性反应。

2.3与已报道芸薹属Ogura恢复系的比较

将上述结果分别与Primard-Brisset等[16]和Chen等[19]所列举的具有Rfo基因的RRH1、R113、R211、R2000、CLR650等5个材料进行对比，结果(图6)表明： R2572比RRH1缺少2个萝卜标记(ScH03和BolJon)，比R113缺少1个萝卜标记(BolJon)，比R2000、CLR650、R211缺少1个萝卜标记(BolJon)，而多1个萝卜标记(PGIint)。因此可以初步鉴定恢复系R2572与恢复系RRH1、R113、R211、R2000、CLR650不同。

SRF系是由美国先锋国际良种公司选育出来的一个芸薹属Ogura恢复系，已申请专利保护(专利号200980109801.9)。SRF系的恢复基因位于渗入的Raphanus片段上，由于缺乏该恢复系以及专利中列出的恢复材料，因此选取专利中的分子标记结果与本研究中R2572的检测结果进行对比，结果(图7)表明，SRF系缺少RMC25标记，而R2572含有RMC25标记。因此初步判断R2572与SRF系可能存在差异。如表2所示，R2572系与NW1717的分子标记结果相同，因此推测R2572可能与NW1717萝卜片段的长短较为接近。根据专利中所列出的法国农科院的R2000、R211与R113的分子标记结果作为对照，可以看出R2572比R211和R2000缺少E33M47、E32M50、OPN20、OPH15、IN6RS4、E33M58等6个标记；比R113缺少E33M47、E32M50、OPN20、OPH15、IN6RS4、E33M58、E33M59A、E33M59B等8个标记，因此可以初步说明R2572可能与法国农科院的R2000、R211、R113有所差异。

图 6　恢复基因连锁分子标记的比较

图 7　标记RMC25的PCR扩增结果

标记组MarkergroupRf标记RfmarkerR2572SRF-R1439SRF-R1815SRF-R1931NW1717R2000-INRAR211-INRAR113-INRARMA0110001111ⅠRMA0210001111RMA0810001111RMA1010001111RMB0111111111E35M6211111111RMB0211111111ⅡRMB0411111111RMB0811111111RMB1011111111OPF1011111111RMB1211111111

续表 2　Continued table 2

注：“1”表示含有此标记；“0”表示无此标记。

Note:“1” stands for with the marker;“0” stands for without the marker.

3结论与讨论

三系配套系统对于甘蓝型油菜杂种制种是至关重要的。甘蓝型油菜萝卜质雄性不育恢复系2572由于携带的萝卜渗入片段过长，且这些片段导致恢复系的高硫苷和较差的农艺性状，不利于农业生产。减数分裂具有的不稳定性可以促进同源染色体的重组和配对。本课题组利用农艺性状较好的甘蓝型油菜萝卜质雄性不育系作为遗传背景，通过杂交、自交缩短恢复系中渗入的萝卜片段，获得了18个对Ogura CMS具有完全恢复作用的恢复系，从而改善恢复系2572的农艺性状。

本研究通过对18个恢复材料进行基于恢复基因Rfo的特异性标记检测，结果表明18个恢复材料均含有Rfo基因。选取5个与Rfo基因连锁的标记对18个恢复材料进行检测，结果表明恢复系R2572缺少标记ScH03和BolJon，因此可以初步判断恢复系R2572可能与恢复系R113、RRH1、R211、R2000、CLR650有所不同。与美国先锋国际良种公司具有缩短Raphanus片段(SRF)的新芸苔属Ogura恢复系分子标记结果对比表明，恢复系R2572与SRF系不同，但与恢复系NW1717的萝卜渗入片段长短接近。同时恢复系R2572与专利中列出的法国农科院的恢复系R113、R2000和R211的分子标记结果进行对比，进一步表明恢复系R2572中的萝卜渗入片段可能短于恢复系R113、R211、R2000，是与之不同的萝卜质雄性不育恢复系。

由于生物体内存在个别碱基突变的情况，而该情况的发生可能导致引物无法与碱基片段结合，无法产生扩增的目的片段。因此本研究还有待于在获得国外受专利保护的恢复材料后进行进一步的测序比对验证。

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Molecular markers of Ogura CMS restorers R2572 inBrassicanapus

YANG Qi-dong,XI Kun,DONG Jun-gang,ZHANG Bo,XU Ting,DONG Zhen-sheng

(CollegeofAgronomy,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:【Objective】 This study conducted molecular research on 18 Ogura CMS restorers (R2572) in Brassica napus with one specific marker for Ogura CMS restoring gene Rfo and its linkage markers to select different restorers from similar foreign materials.【Method】 Molecular detection on 18 Ogura CMS restorers (R2572) was conducted using one Rfo specific marker,5 radish markers linked with Rfo,and specific markers of SRF line.Testing results were compared with similar restorers (RRH1,R113,R211,R2000,CLR650,SRF and NW1717).【Result】 All the 18 restorers of R2572 contained Ogura CMS restorer gene Rfo.Compared to R113,R211 and R2000,R2572 lacked markers E33M47,E32M50,OPN20,OPH15,IN6RS4,E33M58,BolJon and ScH03 but owned PGlint.R2572 had the same markers as NW1717.【Conclusion】 R2572 may be different from RRH1,R113,R211,R2000,CLR650 and SRF,and its length was similar to of radish fragment with NW1717.

Key words:Brassica napus;Ogura CMS;restorer line;radish fragment;molecular markers

DOI：网络出版时间:2016-03-1408:4510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.04.008

[收稿日期]2015-09-06

[基金项目]陕西省科技统筹创新工程计划项目“主要粮油作物新品种选育”(2011KTZB02-01-03)

[作者简介]杨其东(1990-)，男，吉林白山人，在读硕士，主要从事作物杂种优势理论与应用研究。E-mail：jlbsyqd@126.com[通信作者]董振生(1957-)，男，陕西永寿人，研究员，硕士生导师，主要从事油菜遗传育种研究。E-mail：dzs05319@163.com

[中图分类号]S634.3

[文献标志码]A

[文章编号]1671-9387(2016)04-0057-07

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160314.0845.016.html