二甲双胍与西格列汀对非酒精性脂肪肝病大鼠肝脏FGF21及SREBP-1c mRNA表达的影响

申　甜，喻　明，章志建，徐碧林，张翠平

二甲双胍与西格列汀对非酒精性脂肪肝病大鼠肝脏FGF21及SREBP-1c mRNA表达的影响

申甜，喻明*，章志建，徐碧林，张翠平

上海市普陀区中心医院，上海 200062

[摘要]目的比较二甲双胍及西格列汀对高脂饮食诱导大鼠肝脏FGF21 mRNA及SREBP-1c mRNA的作用。方法将60只SD大鼠随机分为正常组20只(普通饲料,NC组)及高脂组40只(高脂饮食，HF组)，喂养8周后，每组随机抽取10只，比较后证实HF组NAFLD模型成功建立。继将HF组分3组：二甲双胍干预组(HF+M，10只)[加二甲双胍500 mg/(kg·d)]、西格列汀干预组(HF+XI，10只)[加西格列汀10 mg/(kg·d)]及高脂组(HF1，10只)(等体积生理盐水)。灌胃8周末处死，检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、游离脂肪酸(FFA)含量，空腹血糖(FBG)及胰岛素(FINS)水平，计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)；HE染色观察肝脏病理形态学的变化；Real-time PCR检测肝组织FGF21 mRNA及SREBP-1c mRNA表达的变化。结果两种药物均可降低血清ALT、AST活性(P<0.05)，减少TC、TG、FFA含量，FBG、肝脏TG含量及HOMA-IR(P<0.05)；西格列汀可明显改善大鼠肝脏脂肪变，效果优于二甲双胍；二甲双胍可下调肝组织SREBP-1c mRNA表达量，上调FGF21 mRNA表达量(P<0.01)，而西格列汀可同时降低肝脏FGF21 mRNA及SREBP-1c mRNA表达量(P<0.01)。结论西格列汀与二甲双胍均可有效减少肝脏TG含量，但西格列汀改善肝组织病理变化较二甲双胍明显，而二甲双胍减轻HOMA-IR强于西格列汀；同时，二者均可不同程度影响肝组织SREBP-1c与FGF21 mRNA表达量。

[关键词]二甲双胍；西格列汀；非酒精性脂肪性肝病

0引言

流行病学显示，我国普通人群非酒精脂肪肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)患病率为12%～17%，而患者中有21%～45%发生糖尿病，且有学者发现，NAFLD可以预测2型糖尿病(T2DM)的发生和发展。李华亭等[1]发现，血清成纤维细胞生长因子21(FGF21)水平对NAFLD的早期诊断具有一定的特异性及准确性；而固醇调节元件结合蛋白-1c(Sterol regulatory element-binding protein1c，SREBP-1c)主要在肝脏和脂肪细胞表达，可调控体内的脂肪合成，与肝脏脂质沉积有关。胰岛素抵抗(IR)在NAFLD及T2DM形成中起到关键作用[2-4]，故改善IR将成为防治NAFLD的一个主要方向[5]。本实验对高脂诱导NAFLD大鼠分别选用二甲双胍及西格列汀干预8周，探讨二者对肝脏TG含量、肝组织病理组织学及胰岛素抵抗、肝组织FGF21 mRNA及SREBP-1c mRNA表达的影响。

1材料与方法

1.1动物选用SPF级6～8周龄、体重(180±10)g雄性SD大鼠60只，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证号：SCXK(沪)2012-0002，由上海市普陀区中心医院动物饲养中心分笼喂养，动物房内通风良好，室温保持在18～25 ℃，相对湿度40%～60%，光照时间每天12 h。

1.2实验药物盐酸二甲双胍片(500 mg/片，上海施贵宝制药公司，批号：1112103)；西格列汀由默沙东馈赠(100 mg/片，杭州默沙东制药有限公司分装，批号：J20120058)。

1.3动物分组及模型建立所有大鼠正常喂养1周后，随机分为正常组(NC组，20只)、高脂组(HF组，40只)。NC组给予基础饲料(蛋白质21%、脂肪6%、碳水化合物55%)喂养，HF组给予高脂饲料(上海斯莱克实验动物有限公司定制，组成为83%基础饲料，10%猪油，5%蔗糖，1.5%胆固醇，0.5%胆盐)喂养。8周后，每组抽取10只，进行称重、检测生化学指标，行肝组织病理检测，HF组证实NAFLD造模成功。将HF组大鼠按随机数字表法分为高脂组(HF1组,等体积生理盐水)、二甲双胍干预组[HF+M组,加二甲双胍500 mg/(kg·d)]、西格列汀干预组[HF+XI组,加西格列汀10 mg/(kg·d)]，每组10只，连续灌胃8周。8周结束后，各组动物于末次给药后，禁食不禁水12 h，行乙醚腹腔麻醉大鼠，称重，腹主动脉采血，分离血清；迅速取出肝脏并称重，计算肝脏指数(肝脏湿重/体重)；取相同部位肝右叶用10%中性甲醛固定，作肝组织病理学观察，其余肝脏-70 ℃冻存备用，行FGF21及SREBP-1c mRNA检测。

1.4实验试剂血清FFA、肝脏三酰甘油(TG)及胰岛素试剂盒均购自上海博谷生物有限公司，RT-PCR试剂盒TRIzol、PrimeScript RT-PCR Kit和Premix EX Taq购自TaKaRa。

1.5指标检测

1.5.1生化指标采用日本OLYMPUS公司AU2700型全自动生化检测仪检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆固醇(TC)、TG、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)，空腹血糖(FBG)。

1.5.2IR评价方法血清胰岛素采用放射免疫方法进行检测，稳态模型IR指数(HOMA-IR)计算方法为：HOMA-IR=空腹血糖×空腹血清胰岛素/22.5。

1.5.3肝组织行病理学检查将取出的肝组织，大小约2 cm×2 cm×0.3 cm，用4%甲醛溶液固定，制备石蜡切片，行HE染色，观察肝细胞脂肪变性程度、炎性活动度及肝纤维化的程度，相关标准参照Dixon等[6]提出的肝细胞脂肪变分级方法及2000年全国肝病会议通过的肝纤维化分期方法[7]。

1.5.4氯仿∶甲醇(2∶1)肝脏匀浆液的制备及TG含量测定称取适量肝脏组织，放入玻璃匀浆管中，加入3倍体积的甲醇，1 500 r/min电动匀浆5 min，倒入具塞离心管中，再加入6倍体积的氯仿，漩涡混合器混匀，制备10%的组织匀浆，根据TG测定试剂盒对TG含量进行测定。

1.5.5肝脏FGF21 mRNA表达水平检测肝脏RNA提取和cDNA合成：组织RNA提取参考所附步骤。所有RNA光密度分析结果260 nm/280 nm均在1.8～2.2之间。按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA。PCR反应采用SYBRGreen试剂(ABI公司，美国)，在ABI 7300 Real Time PCR仪上设定反应条件，反应条件为:95 ℃ 30 s变性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，45个循环。目的基因mRNA表达水平相对定量与分析:反应结束后，ABI7300 SDS Software自动分析荧光信号并将其转换Ct值。Ct值取三复管平均值。△Ct为目的基因Ct值与内参Ct值的差值。引物设计和合成:所有基因序列均从GenBank中获取，引物用Primer 5.0软件进行设计，上海闪晶公司合成。引物序列见表1。

表1　引物序列

2结果

2.18周后两组大鼠相关指标比较8周后HF组大鼠体重、肝脏湿重及肝指数高于NC组，差异有统计学意义(P<0.05)，提示造模成功。HF组大鼠血清FINS、FFA、AST、ALT、TG、TC，肝脏TG、HOMA-IR和FGF21明显高于NC组(P<0.05)，而两组FBG差异无统计学意义。见表2。

表2　8周后两组大鼠相关指标比较

注：与NC组比较，*P<0.05

2.28周后两组肝脏组织学及病理观察肉眼观察NC组大鼠肝脏形态正常。HF组大鼠第8周起肝脏外形稍饱满圆钝，色红，质地较脆。光镜观察：8周后NC组肝小叶结构完整，轮廓清晰，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝小叶肝细胞分界清晰，胞核圆，位于细胞中央，胞质丰富，未见肝细胞脂肪变性或坏死及炎性细胞浸润；HF组肝小叶结构模糊，肝索放射状排列不明显，大部分细胞肿胀，胞核消失或被脂肪空泡。

2.3药物干预8周后各组生化指标、FGF21、FFA测定及胰岛素抵抗指数的比较见表3。

2.4肝组织形态学及病理观察

2.4.1肝组织形态学灌胃8周末，肉眼观察NC组大鼠肝脏形态正常；HF组大鼠肝脏外形稍饱满圆钝，色变黄，肝脏体积明显增大，包膜紧张，触之有油腻感。二甲双胍及西格列汀组肝脏色泽暗黄，较单纯高脂组肝脏体积缩小，但仍有部分油脂沉积。

2.4.2光镜下HE染色HF组呈渔网状，肝小叶内及汇管区可见大量以单核、淋巴细胞为主的炎症细胞浸润及点状坏死，所有标本均未见肝纤维化。HF+M组肝小叶结构紊乱，但肝细胞空泡样变及胞浆疏松化略有减轻，未见肝细胞坏死；而HF+XI组肝小叶结构基本正常，无肝细胞脂滴及细胞气球样变，无明显炎症细胞浸润，明显优于HF+M组。见图1～图3。

2.5FGF21与SREBP-1c mRNA表达HF组肝SREBP-1c及FGF21 mRNA表达明显高于NC组，差异有统计学意义(P<0.05)。与HF组相比，二甲双胍干预后，FGF21 mRNA表达量明显增多(P<0.05)，而SREBP-1c mRNA表达量下降(P<0.01)；西格列汀干预后，FGF21 mRNA表达量、SREBP-1c mRNA表达量均下降(P<0.01)。

3讨论

NAFLD指除外酒精及其他明确肝脏损害因素，由遗传-环境-代谢应激相关因素联合所致的脂质特别是TG在肝细胞沉积导致弥漫性肝细胞脂肪变为主要特征的临床病理综合征。NAFLD人群是T2DM及心血管疾病(CVD)的高危人群。究其原因，胰岛素抵抗为NAFLD及T2DM的共同发病中心环节，而二甲双胍具有明确的改善IR及调节糖脂代谢的作用，从而用于NAFLD的治疗。临床观察也发现，对合并NAFLD的T2DM患者，使用二肽基肽酶Ⅳ(DPP-4)单药或联合干预治疗后，在血糖下降的同时，血脂、肝功能也有较明显的改善[8-9]，但确切的机制尚不清楚。本研究发现，使用DPP-4抑制剂西格列汀可明显改善NAFLD大鼠肝脏脂肪变，效果优于二甲双胍；二甲双胍对改善IR的作用明显优于西格列汀；同时，二甲双胍能显著降低血清AST、ALT、TG、TC、FFA、FBG及肝脏TG含量，且效果优于西格列汀。

表3　药物干预8周后各组生化指标、FGF21、FFA测定及胰岛素抵抗指数的比较

注：与NC组比较，*P<0.05；与HF1组比较，#P<0.05；与HF+M比较，△P<0.05

图1　16周HF1组(HE,×100)

图2　16周HF+M组(HE,×100)

图3　16周HF+XI(HE,×100)

FGF21主要由肝组织、脂肪组织和胰腺分泌，其具有内源性调节糖脂代谢及胰岛素分泌调控的作用；以往研究发现，血清FGF21水平在非酒精性脂肪肝患者中明显增高[10-12]。颜红梅等[13]证实，NAFLD患者血清FGF21水平是反应非酒精性脂肪肝患者肝脏脂肪含量的潜在性生物学指标，FGF21浓度与肝脏脂肪含量有关。此外，在对白种人进行的为期5.3年的随访中，发现FGF21是代谢综合征和T2DM的独立预测因子[14]。笔者既往研究发现，血清FGF21与肝脏FGF21 mRNA变化呈一致性，且早期脂肪肝阶段FGF21 mRNA与肝脏TG含量呈正相关性，故血清FGF21可以作为NAFLD的早期诊断预测因子。

作为脂代谢异常-非酒精性脂肪肝形成的主要发病机制之一[15-16]，SREBP-1c在脂质代谢及沉积发挥关键作用。SREBP-1c属于碱性-螺旋-环-螺旋-亮氨酸锌超家族的一员，是一种核转录因子，在人类和啮齿类动物中，SREBP-1c主要在肝脏和脂肪细胞表达，它通过作用其靶基因FAS和乙酰辅酶A羧化酶来调控体内的脂肪合成，与肝脏脂质沉积有关[17]。NAFLD患者肝活检组织SREBP-1c mRNA表达上调[17]，高脂饲料喂养小鼠9个月后，肝FAS mRNA的表达和蛋白含量显著增加，小鼠出现脂肪肝[18]。本实验发现，高脂组大鼠肝组织SREBP-1c及FGF21 mRNA表达明显高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

既往笔者观察到在高脂喂养过程中，肝脏FGF21 mRNA表达呈现先升高后下降的变化，推测早期FGF21升高可能为保护性改变，而后期受外周胰岛素抵抗的相对抑制。二甲双胍干预后，使血清FGF21水平及肝脏FGF21 mRNA表达较高脂组明显升高，提示此种升高是保护性反应的增强，且差异有统计学意义(P<0.05)。此结果与Nygaard等[19]的结果(作为间接的AMPK激动剂，二甲双胍可刺激FGF21在原代肝细胞的表达)相一致。同时，二甲双胍可显著下调脂质代谢调控因子SREBP-1c mRNA在肝脏的表达，提示干预后肝内脂肪酸合成减少，氧化分解代谢增强。Ding等[20]及Souza等[21]研究西格列汀对高脂饮食诱导的NAFLD小鼠模型的干预疗效，与高脂组相比，可使肝内脂肪含量、胰岛素抵抗指数及肝组织SREBP-1/PPARa比值均下降；DING等[22]研究艾塞那肽干预ob/ob小鼠2个月的研究结果显示，GLP-1干预增加PPARa，减少SCD-1及SREBP-1c在肝组织内的表达。本实验发现，西格列汀可减少肝脏SREBP-1c mRNA表达，推测其可能通过有效抑制肥胖大鼠肝脏SREBP-1c基因表达，进而影响脂肪酸合成代谢，减少肝脏TG沉积及FGF21 mRNA的表达，其确切机制仍有待进一步研究。

参考文献：

[1]Li H,Dong K,Fang Q,et al.High serum level of fibroblast growth factor 21 is an independent predictor of non-alcoholic fatty liver disease:a 3-year prospective study in China[J].J Hepatol,2013,58(3):557-563.

[2]Samuel VT,Liu ZX,Qu X,et al. Mechanism of hepatic insulin resistance in non-alcoholic fatty liver disease[J].J Biol Chem,2004,279(31):32345-32353.

[3]Neuschwander-Tetri BA,Caldwell SH.Nonalcoholic steatohepatitis:summary of an AASLD Single Topic Conference[J].Hepatology,2003,37(5):1202-1219.

[4]Choudhury J,Sanyal AJ.Insulin resistance and the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease[J].Clin Liver Dis,2004,8:575-594.

[5]Bugianesi E,Zannoni C,Vanni E,et al.Non-alcoholic fatty liver and insulin resistance:a cause-effect relationship[J].Dig Liver Dis,2004,36:165-173.

[6]Dixon JB,Bhathal PS,Hughes NR,et al.Nonalcoholic fatty liver disease:improvement in liver histological analysis withweight lose[J].Hepatology,2004,39:1647-1654.

[7]中华医学会,传染病与寄生虫病学分会.病毒性肝炎防治方案[J].中华内科杂志,2001,40(1):62-68.

[8]Iwasaki T,Yoneda M,Inamori M,et al.Sitagliptin as a novel treatment agent for non -alcoholic fatty liver disease patients with type 2 fatty liver disease patients with type 2 diabetes mellitus[J].Hepatogastroenterology,2011,58(112):2103-2210.

[9]Flock G,Baggio LL,Longuet C,et al.Incretin receptors for glucagon-like peptide 1 and glucose-dependent insulino tropic polypeptide are essential for the sustained metabolic actions of vildagliptin in mice[J].Diabetes,2007,56(12):3006-3013.

[10]Li H,Fang Q,Gao F,et al.Fibroblast growth factor 21 levels are increased in non-alcoholic fatty liver disease patients and are correlated with hepatic triglyceride[J].Hepatol 2010,53:934-940.

[11]Dushay J,Chui PC,Gopalakrishnan GS,et al.Increased fibroblast growth factor 21 in obesity and non-alcoholic fatty liver disease[J].Gastroenterology,2010,139:456-463.

[12]Yilmaz Y,Eren F,Yonal O,et al.Increased serum FGF21 levels in patients with non-alcoholic fatty liver disease[J].Eur J Clin Invest,2010,40:887-892.

[13]Yan H,Xia M,Chang X,et al.Circulating fibroblast growth factor 21 levels are closely associated with hepatic fat content:a cross-sectional study[J].PLoS One,2011,6:e24895-e24902.

[14]Bobbert T,Schwarz F,Fischer-Rosinsky A,et al.Fibroblast growth factor 21 predicts the metabolic syndrome and diabetes type 2 mellitus in Caucasians[J].Diabetes Care,2013,36(1):145-149.

[15]范建高,郑晓英,田丽艳,等.非酒精性脂肪性肝病大鼠血浆前列环素与血栓素的变化及其与肝脏损伤的关系[J].中华肝脏病杂志,2004,12(11):681-683.

[16]Goto T,Yoshino R,Wat anabe S.Non-alcoholic steatohepatitis(NASH).1.General concept[J].Nippon Naika Gakkai Zasshi,2006,95(1):39-45.

[17]Higuchi N,Kato M,Shundo Y,et al.Liver X receptor in cooperation with SREBP-1c is a major lipid synthesis regulator in nonalcoholic fatty liver disease[J].Hepatol Res,2008,38(11):1122-1129.

[18]Morgan K,Uyuni A,Nandgiri G,et al.Altered expression of transcription factors and genes regulating lipogenesis in liver and adipose t issue of mice with high fat diet-induced obesity and nonalcoholic fatty liver disease[J].Eur J Gastroenterol Hepatol,2008,20(9):843-854.

[19]Nygaard EB,Vienberg SG.Metformin stimulates FGF21 expression in primary hepatocytes[J].Exp Diabetes Res,2012,2012:465282-465290.

[20]Ding X,Saxena NK,Lin S,et al.Exendin-4,a glucagon-like protein-1(GLP-1)receptor agonist,reverseshepatic steatosis in ob/ob mice[J].Hepatology,2006,43(1):173-181.

[21]Souza MV,Bianca M,Orio G,et al.Comparative effects of telmisartan,sitagliptin and metformin alone or in combination on obesity,insulin resistance,and liver and pancreas remodelling in C57BL/6 mice fed on a very high-fat diet[J].Clin Sci,2010,119(6):239-250.

[22]Shirakawa J,Fujii H,Ohnuma K,et al.Diet-induced adipose tissue inflammation and liver steatosis are prevented by DPP-4 inhibition in diabetic mice[J].Diabetes,2011,60(4):1246-1257.

Influence of metformin and sitagliptin on the expression of SREBP-1c mRNA and FGF21 mRNA in liver tissue of NAFLD rats

SHEN Tian,YU Ming*,ZHANG Zhi-jian,XU Bi-lin,ZHANG Cui-ping

(Department of Endocrinology,Shanghai Putuo District Center Hospital,Shanghai 200062,China)

[Abstract]ObjectiveTo compare the effect of metformin and sitagliptin on the expression of liver SREBP-1c mRNA and FGF21 mRNA in rats induced by high fat-diet.MethodsSixty SD rats were randomly divided into two groups:normal control group (NC group,n=20,fed with normal diet),high fat group (HF group,n=40,fed with high fat diet),after 8-week feeding,10 rats were randomly selected from two groups respectively,and NAFLD model of HF group was confirmed to be built successfully compared with NC group.Rats in HF group was divided into 3 groups:metformin treatment group (HF+M,n=10) [plus metformin 500 mg/(kg·d)],sitagliptin treatment group (HF+XI,n=10) [only sitagliptin 10 mg/(kg·d)] and HF1 group (n=10) (only an equal volume of saline).The serum contents of alanine transferase (ALT),aspartate aminotransferase (AST),total cholesterol (TC),total glyceride (TG) and free fatty acid (FFA) were detected after 8-week lavage;the fasting serum glucose and insulin (FINS) level were measured and the insulin resistance index (HOMA-IR) was calculated;HE staining was carried out to observe the liver pathological changes and the expression levels of FGF21 and SREBP-1c mRNA were measured using Real-time PCR.ResultsIn all treatment groups,the serum content of ALT,AST,TC,TG,FFA and TG and HOMA-IR were reduced significantly (P<0.05),the pathological changes of the rat liver were reduced significantly by sitagliptin,which was significantly better than metformin,the expression of SREBP-1c mRNA in the liver was reduced by the metformin and FGF21 mRNA was increased,but the expression of SREBP-1c mRNA and FGF21 mRNA in the liver was also reduced significantly by sitagliptin (P<0.01).ConclusionSitagliptin and metformin can effectively reduce the content of TG in the liver,but the liver pathological changes improved by sitagliptin are better than by metformin,while metformin can reduce HOMA-IR more significantly than sitagliptin;and both of them can change SREBP-1c and FGF21 mRNA expression in the liver tissue in different degree.

Key words：Metformin;Sitagliptin;Non-alcoholic fatty liver disease

收稿日期：2015-10-10

基金项目：上海中医药大学后备业务专家培养；上海市卫生局项目

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201605002