1,3-二苯-1,3-丙二酮对可卡因致小鼠神经递质含量变化的影响

陈　娟，王一超，崔　蓉△，刘晓晓，张宝旭

(北京大学公共卫生学院 1. 劳动卫生与环境卫生学系，2. 毒理学系，北京　100191)

·论著·

1,3-二苯-1,3-丙二酮对可卡因致小鼠神经递质含量变化的影响

陈娟1，王一超1，崔蓉1△，刘晓晓2，张宝旭2

(北京大学公共卫生学院 1. 劳动卫生与环境卫生学系，2. 毒理学系，北京100191)

[摘要]目的：探讨1,3-二苯-1,3-丙二酮(1,3-diphenyl-1,3-propanedione，DPPD)对可卡因所致小鼠神经递质含量变化的影响。方法： 36只雄性健康的ICR小鼠随机分为对照组、可卡因组、3个DPPD预给药组(200、400、800 mg/kg)和DPPD单独给药组(800 mg/kg)。对照组灌胃给予1%(体积分数)吐温3 d；可卡因组灌胃给予1%吐温2 d，第3天皮下注射可卡因；3个DPPD预给药组小鼠分别灌胃给药(DPPD 200、400、800 mg/kg)3 d，第3天给药30 min后皮下注射可卡因；DPPD单独给药组用DPPD 800 mg/kg灌胃给药3 d。给予可卡因20 min后处死小鼠，采用高效液相色谱法-荧光检测器检测小鼠脑组织中多巴胺(dopamine，DA)和5-羟色胺(5-hydroxytryptamin，5-HT)的含量，采用高效液相色谱法-紫外检测器检测小鼠脑组织中谷氨酸(glutamic acid，Glu)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)的含量，比较各组间神经递质的水平。结果： 与对照组相比，可卡因组小鼠脑中DA和GABA含量明显升高(P<0.01和P<0.05)，Glu含量显著降低(P<0.05)。与可卡因组相比，DPPD预给药组(200、400、800 mg/kg)小鼠脑中DA含量明显下降(P<0.01)，DPPD预给药200 mg/kg组小鼠脑中GABA含量明显下降(P<0.05)。DPPD预给药200 mg/kg组小鼠脑中DA、5-HT、Glu和GABA含量与对照组的差异均无统计学意义。结论： 低剂量DPPD可逆转可卡因致小鼠神经递质含量的改变。

[关键词]1,3-二苯-1,3-丙二酮；可卡因；神经递质；小鼠；色谱法，高压液相

可卡因是强天然中枢神经兴奋剂，因其对中枢神经系统的兴奋作用而易导致成瘾和滥用。可卡因作用于中枢神经系统可影响多种神经递质的传递，导致其功能紊乱，影响的神经递质主要包括多巴胺(dopamine，DA)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamin，5-HT)、去甲肾上腺素、谷氨酸(glutamic acid，Glu)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)和胆碱能递质系统等[1-5]。

1,3-二苯-1,3-丙二酮(1,3-diphenyl-1,3-propanedione, DPPD)是从甘草中提取的成分，是姜黄素的β-二酮类似物。多项研究显示，DPPD对前列腺癌、肺癌、乳腺癌、淋巴癌、白血病等多种肿瘤具有抑制作用[6-9]，对二甲基甲酰胺、对乙酰氨基酚、四氯化碳、可卡因引起的小鼠化学性肝损伤具有保护作用[10-13]。研究表明DPPD可通过抗氧化应激和内质网应激来保护多巴胺神经元[14]，可明显减弱可卡因诱发的小鼠自主活动量的增加[13]，提示DPPD对可卡因所致的小鼠神经毒性具有拮抗作用。此前的研究已证实DPPD可通过小鼠血脑屏障[15]，表明DPPD可到达小鼠脑组织并有可能发挥相关的生理作用。本研究检测不同处理组小鼠脑组织中单胺类(DA和5-HT)和氨基酸类(Glu和GABA)神经递质的含量，旨在探讨DPPD对可卡因所致小鼠脑中神经递质含量变化的影响。

1 材料与方法

1.1仪器

Waters高效液相色谱仪包括Waters 1525 Binary HPLC Pump、Waters 717 puls Autosampler、Waters 2475 Multi λ Fluorescence Detector(用于DA和5-HT的检测)和Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector(用于Glu和GABA的检测)。其他仪器有4 ℃高速离心机(Thermo scientific)、XW-80A旋涡混合仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)、D-130型手持式超细匀浆器(德国Wiggens公司)和恒温水浴锅(精科华瑞仪器有限公司)。

1.2试剂

主要试剂有多巴胺盐酸盐、5-羟色胺盐酸盐(Sigma-Aldrich公司)，Glu、GABA(纯度99%，J & K科技有限公司)，DPPD(纯度99%，德国Merck公司)，盐酸可卡因(青海制药厂)，2,4-二硝基氟苯(纯度99.0%，成都艾科达化学试剂有限公司)，乙二胺四乙酸二钠、无水乙酸钠、盐酸(分析纯，北京化工厂)，冰醋酸(纯度≥99.5%)、碳酸氢钠(纯度≥99.8%，北京化工厂)，乙腈、甲醇(纯度≥99.9%，美国Honeywell B & J公司)，高氯酸(分析纯，天津市东方化工厂)，实验用水为Milli-Q高纯水(电阻率18 MΩ·cm)。

1.3DA和5-HT测定的色谱条件

色谱柱：Waters Symmetry®C18柱(150 mm×3.9 mm，5 μm)；保护柱：Waters Symmetry®C18柱(20 mm×3.9 mm，5 μm)；流动相：0.1 mol/L NaAc(含0.1 mmol/L Na2EDTA)-甲醇(体积比95 ∶5，pH=6.0)；流速：0.8 mL/min；激发波长：280 nm；荧光波长：330 nm；室温：24 ℃；进样量：10 μL[16]。DA和5-HT的加标回收率分别为95.2%～100.4%和82.4%～100.6%。DA的日内和日间精密度分别为2.6%～9.0%和1.8%～8.7%，5-HT的日内和日间精密度分别为2.1%～6.2%和2.2%～10.7%。

1.4Glu和GABA测定的色谱条件

色谱柱：Waters Symmetry®C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；保护柱：Waters Symmetry®C18(20 mm×3.9 mm，5 μm)；流动相：30 mmol/L醋酸钠缓冲溶液(pH 5.6)-乙腈(体积比3 ∶1)；紫外检测波长：360 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：24 ℃；进样量：10 μL[17]。Glu和GABA的加标回收率分别为91.5%～98.7%和94.0%～97.7%。Glu的日内和日间精密度分别为2.8%～7.2%和3.1%～8.2%，GABA的日内和日间精密度分别为2.6%～6.0%和2.5%～5.6%。

1.5动物分组及处理

雄性健康的ICR小鼠36只，SPF级，体重18～20 g，由北京大学医学部实验动物中心提供。小鼠放在塑料笼中，自由采食，适应48 h后称重，按体重随机分为对照组、可卡因组、3个DPPD预给药组和DPPD单独给药组，每组6只。对照组灌胃给予1%(体积分数)吐温3 d；可卡因组灌胃给予1%吐温2 d，第3天皮下注射可卡因80 mg/kg；3个DPPD预给药组分别灌胃给药DPPD 200、400和800 mg/kg，3 d，第3天分别给药30 min后皮下注射可卡因80 mg/kg；DPPD单独给药组灌胃给予DPPD 800 mg/kg，3 d。可卡因组和3个DPPD预给药组的小鼠给予可卡因20 min后处死。

1.6样品处理

在冰面上迅速取出小鼠脑组织，用生理盐水洗净表面的血液后，用滤纸吸干后称重，-80 ℃保存。测定前，称取脑组织，按照1 ∶5比例(重量/体积比)加入0.1 mol/L高氯酸溶液，冰浴匀浆。匀浆液涡旋1 min，混匀后置于4 ℃高速离心机中14 000 r/min离心30 min，取上清液分成两份，一份经0.22 μm PES聚醚砜过滤器过滤后，采用高效液相色谱法-荧光检测器检测小鼠脑组织中DA和5-HT的含量[16]；另一份取上清液100 μL，加入1%(体积分数)2,4-二硝基氟苯50 μL及0.5 mol/L碳酸氢钠100 μL，85 ℃水浴衍生30 min，用流动相定容至10 mL，采用高效液相色谱法-紫外检测器检测小鼠脑组织中Glu和GABA的含量[17]。

1.7统计学分析

2结果

2.1DPPD对小鼠脑组织中DA和5-HT含量的影响

如图1A所示，与对照组相比，可卡因组小鼠脑组织中DA含量显著升高(P<0.01)；与可卡因组相比，3个DPPD预给药组(200、400、800 mg/kg)及DPPD单独给药组(800 mg/kg)小鼠脑中DA含量明显下降(P<0.01)，且DPPD预给药组(200、800 mg/kg)及DPPD单独给药组小鼠脑中DA含量与对照组差异无统计学意义。与对照组相比，DPPD预给药400 mg/kg组和800 mg/kg组小鼠脑中5-HT含量明显升高(P<0.01和P<0.05，图1B)；可卡因组、DPPD预给药200 mg/kg组及DPPD单独给药组小鼠脑中5-HT含量与对照组相比差异无统计学意义。

2.2DPPD对小鼠脑组织中Glu和GABA含量的影响

如图1C所示，与对照组相比，可卡因组(P<0.05)、DPPD预给药400 mg/kg和800 mg/kg组及DPPD单独给药组小鼠脑组织中Glu含量明显下降(P<0.01)。可卡因组、DPPD预给药400 mg/kg组(P<0.05)和DPPD预给药800 mg/kg组(P<0.01)小鼠脑中GABA含量明显高于对照组(图1D)。与可卡因组相比，DPPD预给药400 mg/kg组(P<0.05)、DPPD预给药800 mg/kg组及DPPD单独给药组小鼠脑中Glu含量明显下降(P<0.01)；DPPD预给药200 mg/kg组小鼠脑中GABA含量明显下降(P<0.05)。

*P<0.05, **P<0.01, compared with control group; # P<0.05, ## P<0.01, compared with cocaine group. n=6, but one mouse died in DPPD pretreatment 400 mg/kg group and DPPD group (n=5). DA, dopamine; 5-HT, 5-hydroxytryptamin; Glu, glutamic acid; GABA, γ-aminobutyric acid; DPPD, 1,3-diphenyl-1,3-propanedione. 图1　DPPD对可卡因致小鼠脑组织中DA、5-HT、Glu、GABA含量变化的影响Figure 1　Effects of DPPD on DA, 5-HT, Glu, and GABA contents of brain in mice administered with cocaine

3讨论

可卡因是强天然中枢神经兴奋剂，目前认为可卡因发挥强化效应最主要的机制是通过抑制DA再摄取。可卡因与多巴胺转运体(dopamine transpor-ter，DAT)结合，阻断DAT把DA由突触间隙转运到细胞内，导致DA在突触间隙的异常积累，持续作用于突触后体而让使用者产生欣快感[18]。Liu等[19]报道急性注射可卡因30 mg/kg可分别增加大鼠纹状体和伏核中DA水平23.6%和25.1%。另一项研究结果也显示可卡因急性给药后可增加大鼠纹状体中DA的浓度[20]。本研究中，与对照组相比，可卡因组小鼠脑组织中DA含量显著升高，而3个DPPD预给药组及DPPD单独给药组小鼠脑中DA含量与可卡因组相比均明显下降，提示DPPD可逆转可卡因所致小鼠脑组织中DA含量的升高。

有研究表明除了抑制DA的再摄取，可卡因还可抑制5-HT的再摄取，增加其在突触间隙的水平[2]。可卡因急性给药后可增加小鼠或大鼠中不同脑区5-HT的水平[21-22]，但也有研究显示可卡因给药后，大鼠脑中DA水平显著增加，而5-HT水平无明显变化[23]。本研究中，可卡因组、DPPD 200 mg/kg预给药组与对照组间5-HT水平差异均无统计学意义，但中、高剂量DPPD预给药组的5-HT水平明显高于对照组，提示DPPD有可能影响小鼠脑中5-HT水平。

研究显示Glu可能通过改变神经元可塑性、产生长期记忆而参与药物的成瘾过程[3]。GABA可调节可卡因引起的行为反应，其作用机制可能是通过多巴胺受体间接发挥作用[5]。可卡因给药后对Glu和GABA含量的影响不同研究所得结论不完全一致。有研究发现可卡因急性给药可增加大鼠不同脑区中Glu水平[24-26]，但也有研究表明急性或慢性可卡因给药并不会改变大鼠纹状体中Glu水平[19]。Wydra等[27]发现可卡因给药后大鼠脑中DA水平显著增高，而腹侧苍白球区中Glu水平没有变化，GABA水平显著降低。Miguéns等[28]则发现可卡因给药可显著增加大鼠伏隔核中GABA水平。本研究中，可卡因组Glu水平明显低于对照组，GABA水平明显增高；低剂量DPPD预给药组GABA水平明显降低，中、高剂量DPPD预给药组Glu水平明显低于对照组和可卡因组，而GABA水平明显高于对照组；DPPD单独给药组Glu水平明显低于对照组和可卡因组，提示DPPD对Glu和GABA含量均有一定的影响。

本研究是在已有研究[13]的基础上进行的，该研究结果提示DPPD对可卡因所致的小鼠神经毒性具有拮抗作用。可卡因的作用机制目前尚未完全明了，但很多研究证实可卡因可影响多种神经递质的传递。本研究选择了与可卡因相关的4种神经递质(DA、5-HT、Glu和GABA)进行测定，旨在了解DPPD是否有可能拮抗可卡因所致小鼠神经递质含量的变化，为DPPD作为可能的可卡因治疗药物提供基础实验数据。本研究中3个DPPD预给药组的剂量与文献[13]中报道的一致，同时，参考文献[13]中可卡因的给药剂量，预实验中选择的可卡因剂量分别为50 mg/kg和80 mg/kg，每个剂量组小鼠3只，预实验中未发现小鼠死亡，正式实验中可卡因剂量确定为80 mg/kg。为了解DPPD自身对小鼠脑区4种神经递质的含量是否有影响，本研究安排了DPPD单独给药组与可卡因组和DPPD预给药组同时实验。由于实验中只考察了高剂量DPPD单独给药对小鼠4种神经递质含量的影响，所以无法确定中、低剂量DPPD单独给药时对神经递质含量产生的影响。

本研究以小鼠全脑组织为样本，未测定不同处理组小鼠不同脑区4种神经递质的含量，且样本量较少，同时，采取单一时间点处死小鼠，无法反映4种神经递质含量随时间的变化趋势，这是本研究的局限性，但本研究测定的4种神经递质均取自同一只小鼠脑组织，可综合反映可卡因及DPPD对4种神经递质含量的影响。本研究发现，DPPD对4种神经递质含量均有一定的影响，且低剂量DPPD可很好地逆转可卡因对DA、Glu和GABA含量变化的影响。研究结果中，DPPD中、高剂量组所得结果与低剂量组不完全一致，其原因可能与样本量较少有关，也可能和DPPD与可卡因间复杂的相互作用有关。我们猜测DPPD对神经递质含量的影响可能有着与可卡因相类似的作用，DPPD可能通过竞争性地与靶点结合抑制了可卡因的作用。总之，DPPD与神经递质的时间-效应关系及剂量-效应关系均有待进一步的深入研究。

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(2016-02-02 收稿)

(本文编辑：任英慧)

Effects of 1,3-diphenyl-1,3-propanedione on neurotransmitter contents of brain in mice administered with cocaine

CHEN Juan1, WANG Yi-chao1, CUI Rong1△, LIU Xiao-xiao2, ZHANG Bao-xu2

(1. Department of Occupational and Environmental Health Sciences, 2. Department of Toxicology, Peking University School of Public Health, Beijing 100191, China)

ABSTRACTObjective：To investigate the possible reversal effects of 1,3-diphenyl-1,3-propanedione (DPPD) for cocaine-induced content changes of neurotransmitters of brain in mice. Methods: In this study, 36 healthy ICR male mice were randomly divided into control group, cocaine group, three DPPD pretreatment groups (200, 400, and 800 mg/kg) and DPPD alone group (800 mg/kg). The mice in control group were administered intragastrically with 1% Tween 80 for 3 d, and the mice in cocaine group were administered intragastrically with 1% Tween 80 for 2 d before cocaine was injected subcutaneously on the 3rd day. The mice in the three DPPD pretreatment groups were administered intragastrically (DPPD 200, 400, and 800 mg/kg) for 3 d before cocaine was injected subcutaneously 30 min after the administration on the 3rd day. The mice in DPPD alone group were administered intragastrically with DPPD at dose of 800 mg/kg for 3 d. The mice were sacrificed 20 minutes after cocaine injection. The contents of dopamine (DA) and 5-hydroxytryptamin (5-HT) in the mice brain were determined by high performance liquid chromatography (HPLC)-fluorescence detector, the contents of glutamic acid (Glu) and γ-aminobutyric acid (GABA) in the mice brain were determined by HPLC-ultraviolet detector, and the neurotransmitter levels were compared between the groups. Results: The results showed that as compared with the control group, DA and GABA contents in cocaine group increased significantly (P<0.01 and P<0.05), while Glu content decreased (P<0.05). As compared with cocaine group, the DA levels in the three DPPD pretreatment groups (200, 400, and 800 mg/kg) all decreased significantly (P<0.01). In DPPD 200 mg/kg pre-administration group, GABA content decreased (P<0.05), and the contents of the four kinds of neurotransmitters had no statistical differences with those of the control group. Conclusion: DPPD may have potential reversal effects of the content changes of neurotransmitters in mice brain induced by cocaine at a lower dose.

KEY WORDS1,3-Diphenyl-1,3-propanedione; Cocaine; Neurotransmitter; Mice; Chromatography, high pressure liquid

[中图分类号]R996.5

[文献标志码]A

[文章编号]1671-167X(2016)03-0398-05

doi:10.3969/j.issn.1671-167X.2016.03.004

△ Corresponding author’s e-mail, cuirong19@sohu.com

网络出版时间：2016-5-1213：32：54网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20160512.1332.020.html