中国人群细胞黏附相关基因多态性与非综合征型唇腭裂的关联研究

袁　园，王　苹，吴雅慧，叶晓茜，黄尚志，石　冰，王　科，王竹青，刘冬静，王子凡，吴　涛△，王　红

(1.北京大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系，北京 100191； 2.北京市疾病预防控制中心信息统计中心，北京 100013； 3.林口长庚纪念医院医学研究部，中国台湾桃园市 33305； 4.武汉大学口腔医院儿童口腔科，武汉 430079； 5. Mount Sinai Medical Center, New York 10029, USA； 6.中国医学科学院，北京协和医学院基础学院医学遗传学系，北京 100005； 7.四川大学华西口腔医学院口腔颌面外科，口腔疾病研究国家重点实验室，成都 610041； 8.青岛大学医学院口腔外科，山东青岛 266000；9.北京大学基础医学院，北京 100191)

·论著·

中国人群细胞黏附相关基因多态性与非综合征型唇腭裂的关联研究

袁园1，王苹2，吴雅慧3，叶晓茜4,5，黄尚志6，石冰7，王科8，王竹青1，刘冬静1，王子凡9，吴涛1△，王红1

(1.北京大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系，北京 100191； 2.北京市疾病预防控制中心信息统计中心，北京 100013； 3.林口长庚纪念医院医学研究部，中国台湾桃园市 33305； 4.武汉大学口腔医院儿童口腔科，武汉 430079； 5. Mount Sinai Medical Center, New York 10029, USA； 6.中国医学科学院，北京协和医学院基础学院医学遗传学系，北京 100005； 7.四川大学华西口腔医学院口腔颌面外科，口腔疾病研究国家重点实验室，成都 610041； 8.青岛大学医学院口腔外科，山东青岛 266000；9.北京大学基础医学院，北京 100191)

[摘要]目的：探索中国人群中细胞黏附相关基因多态性与非综合征型唇裂合并或不合并腭裂(isolated non-syndromic cleft lip with or without cleft palate, NSCL/P)的关联关系及可能存在的基因-环境交互作用。方法： 对一项国际多中心的全基因组关联研究(genome-wide association study, GWAS)的数据进行再分析，选取其中806个中国人群NSCL/P核心家庭，对该人群的8个细胞黏附相关基因包括CDH1、CTNNB1、PVRL1、PVRL2、PVRL3、ACTN1、VCL、LEF1进行了传递不平衡检验(transmisssion diseqilibrium test, TDT)及基因-环境交互作用分析。环境因素包括患儿母亲孕期吸烟、被动吸烟、饮酒及服用多种维生素。结果： 经数据质量控制后，共纳入226个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)位点，TDT结果显示，CTNNB1、CDH1、ACTN1基因中有23个SNPs与NSCL/P之间存在关联(P<0.05)，但经Bonferroni校正后，这些关联均无统计学意义(P>0.000 2)。基因-环境交互作用的分析结果显示，14号染色体的ACTN1基因中rs743127位点与母亲孕期被动吸烟的交互作用具有统计学意义(P=0.000 1)，母亲孕期无被动吸烟时携带一个该危险位点的患儿的OR值为0.59(95%CI:0.38-0.90)，患儿母亲孕期中有被动吸烟情况时携带一个危险位点的患儿的OR值为2.00(95%CI:1.23-3.26)。而ACTN1基因的rs1475034、rs370535、rs2273419位点、CTNNB1基因的rs106871位点与被动吸烟和PVRL3基因的rs7634000、rs2971366、rs2634553、rs1489032、rs7624812位点与母亲孕期补充维生素的交互作用并无统计学意义(P>0.000 2)。结论： 传递不平衡检验未发现所纳入的细胞黏附相关基因多态性与NSCL/P存在关联，但基因-环境交互作用分析结果提示，ACTN1基因可能通过基因-环境交互作用而影响NSCL/P的发病风险。

[关键词]ACTN1；唇裂；多态现象，遗传；基因相关性研究；基因-环境交互作用

非综合征型唇裂合并或不合并腭裂(isolated non-syndromic cleft lip with or without cleft palate, NSCL/P)是最常见的出生缺陷之一。我国的唇腭裂发病率处于较高的水平，发病率约为1.20/1 000活产儿[1]。NSCL/P是一种由遗传和环境共同影响的复杂疾病,由双生子研究发现唇腭裂的遗传度可以达到70%或更高[2]。2010年，核心家庭设计的全基因组关联研究(genome-wide association study, GWAS)发现欧洲及亚洲人群中8q24区域及IRF6基因与NSCL/P相关，此外新发现的候选基因有MAFB、ABCA4，潜在的候选基因为PAX7、VAX1、NTN1[3]。2013年Beaty等[4]在欧洲和东南亚人群中对此前的GWAS研究中得出的基因进行验证，IRF6、ABCA4、MAFB基因及8q24区域得到验证。但在NSCL/P的病因探索中，目前发现的易感基因并不能完全解释NSCL/P发生的遗传风险，继续探索其他候选基因对寻找NSCL/P的病因十分重要。

近年来，多个研究发现细胞黏附相关基因可能与唇腭裂发生存在关联[5-12]。细胞间黏附连接对维持组织结构和细胞极性十分重要，它可以限制细胞的移动和扩散。目前细胞黏附相关基因的研究热点为CDH1和PVRL1。CDH1为钙黏素的编码基因，参与上皮细胞钙依赖型细胞间黏附过程[13]。既往研究结果表明，CDH1中的rs16260和rs1801552可能与NSCL/P存在关联[6-7]。参与上皮细胞黏附过程的PVRL1(脊髓灰质炎病毒受体相关基因1)，也为非综合征型唇腭裂的候选基因之一。该基因属于免疫球蛋白超家族，编码黏连蛋白。多个人群研究显示PVRL1突变与NSCL/P存在关联[8-12]。以上研究结果提示细胞黏附分子可能通过影响上皮细胞间黏附过程而影响NSCL/P的发生。然而，关于细胞黏附相关基因是否与唇腭裂存在关联的研究结论并不一致，多项GWAS研究中尚未发现上述基因与非综合征型唇腭裂存在关联。为了探讨中国人群细胞黏附相关基因多态性与NSCL/P之间的关系，本研究在806个中国人群核心家庭中，对8个细胞黏附相关基因的226个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)位点进行了关联分析和基因-环境交互作用分析。

1资料与方法

1.1研究人群

研究人群来自“唇腭裂基因和交互作用的国际合作研究”项目，该项目是一项有关非综合征型唇腭裂的GWAS，其研究设计参见Beaty等[3]研究。本研究是在此GWAS基础上进行的中国人群数据的再次分析，研究对象包括在中国台湾、山东、武汉、四川4个地区募集的806个NSCL/P核心家庭，共2 418人，具体信息参见王苹等[14]研究。核心家庭指1个患者及其父母双亲。患者由临床遗传学家或有经验的医师确定病理类型，排除所有综合征型患者。所研究患儿的父母均签署知情同意书，原始研究获得美国约翰霍普金斯大学医学院伦理委员会的批准。

1.2细胞黏附基因

本研究共纳入8个细胞黏附相关基因，分别为CDH1、CTNNB1、PVRL1、PVRL2、PVRL3、ACTN1、VCL、LEF1。在细胞间的黏着连接中，钙黏素为细胞黏附分子，捆绑着β-连环蛋白，β-连环蛋白与α-连环蛋白相连，α连环蛋白与F-肌动蛋白相连，以上多种蛋白组成钙黏素-肌动蛋白复合物。钙黏素-肌动蛋白复合物的完整性影响着细胞间黏附、细胞迁移及β-连环蛋白的信号水平。细胞黏附过程在胚胎发育时期十分重要，在胚胎发育时期细胞黏附功能受到抑制可能引起唇腭裂的发生。细胞黏附分子及其编码基因间的关系如图1，图中竖线代表细胞膜，方框内为细胞黏附分子及其编码基因(来源于Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG. http://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?ko04520+K05689)。

PVRL1, poliovirus receptor-related 1; PVRL2, poliovirus receptor-related 2; PVRL3, poliovirus receptor-related 3;CDH1, cadherin 1; ACTN1, actinin alpha 1; VCL, vinculin; CTNNB1, catenin beta 1; LEF1, lymphoid enhance-binding factor 1.图1　细胞黏附分子及其编码基因分布情况Figure 1　The distribution of cell adhesion molecules

1.3数据质量控制

本研究的基因型测定工作在美国约翰霍普金斯大学医学院McKusick-Nathans遗传医学研究所遗传病研究中心完成，所得位点信息通过统一的标准进行数据质量控制。控制标准为：(1)基因型的缺失率≤10%；(2)弱势等位基因频率(minor allele frequency, MAF)≥1%；(3)孟德尔遗传错误≤5%；(4)父母人群处在Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。经过数据质量控制，共有226个SNPs纳入分析(表1)。

表1　细胞黏附相关基因基本信息

SNPs, single nucleotide polymorphisms.

1.4环境暴露因素

吸烟、饮酒及服用维生素补充剂的定义为患儿母亲在孕前3个月至孕期最初3个月内主动吸食烟草、饮酒及服用维生素补充剂,被动吸烟定义为患儿母亲在孕前3个月及整个孕期内在家中、工作场所或其他环境中有人在其周围吸烟,以上环境暴露因素信息均通过面对面访问获得。

1.5统计学分析1.5.1关联分析本研究采用核心家庭设计，通过传递不平衡检验(transmisssion diseqilibrium test, TDT)[15]分析候选基因中SNP与疾病的关联关系。该方法通过收集父母和患病子女的基因型信息，评价单个位点上杂合子双亲在传递变异等位基因给子女时是否偏离期望传递率。拒绝无效假设提示该遗传标记位点与潜在疾病位点间连锁且两者处于连锁不平衡状态。传递不平衡检验使用的软件为Plink 1.07。

1.5.2交互作用分析利用Cordell法[16]患儿基因型为病例组，根据每一个核心家庭中父母与患儿的基因型，将未传递给子代的基因型构建成虚拟同胞对照数据库，与患儿基因型组成1∶3匹配的病例对照样本，在加性遗传模型假设下建立条件Logistic回归模型，对常染色体上的位点进行检验。建立的模型为模型1： logit[P|(casei)]=βG(Gi)+βG×E(Gi×Ei)，G=0,1,2代表患儿基因型中的弱势等位基因个数，而E=0或1分别代表患儿母亲未暴露或暴露于环境因素。应用似然比检验(likelihood ratio test, LRT)对该模型的偏回归系数进行检验。将模型1与模型2： logit[P|(casei)]=βG(Gi)，G=0,1,2进行比较，可得自由度为1的似然比统计量及P值，代表对G×E交互作用项的检验。拒绝无效假设，提示模型中位点与环境暴露因素之间的交互作用具有统计学意义。此时OR(CL/P|G no E)=exp(βG)，代表母亲没有该环境暴露的情况下携带一个危险位点的患儿的OR值。OR(CL/P|G and E)=exp(βG+βG×E)代表母亲暴露于当前的环境因素情况下携带一个危险位点的患儿的OR值。模型1与无效假设模型进行比较，可得到自由度为2的似然比统计量及P值，拒绝无效假设，说明考虑基因-环境交互作用后，模型中的位点多态性与疾病之间的关联具有统计学意义。交互作用分析采用R 2.15.2的Trio软件包，与传统的等位基因TDT相比，Trio软件包可以估计不同基因型的OR值及基因-环境交互作用。

1.5.3多重检验的校正 对所得结果进行Bonferroni校正，该校正方法为用显著性水平除以比较的次数来调整P值。本次分析包含226个SNP，传递不平衡检验与每个环境暴露因素的基因-环境交互作用分析的比较次数均为226次，因此设定显著性P值为0.05/226，即当P<0.000 2认为该SNP的传递不平衡检验或交互作用检验具有统计学意义。

2结果

2.1数据基本情况

本研究中男性患儿占66.9%(539/806)，NSCL/P患儿中，单纯唇裂(cleft lip, CL)为25.9%(209/806)，唇裂合并腭裂(cleft lip with cleft palate, CLP)占74.1%(597/806)。排除缺失数据后，本研究患儿母亲的孕期被动吸烟率为40.9%(324/793)，孕期补充多种维生素暴露率为12.9%(84/652)，而孕期吸烟及饮酒的暴露率均不足5%，因此本研究仅对孕期被动吸烟及孕期补充多种维生素进行基因-环境交互作用分析。

2.2TDT检验

对以上8个基因的226个SNPs进行TDT检验，其中23个SNPs与NSCL/P的TDT检验的P值小于0.05。但经多重检验校正后，所有SNPs的TDT检验结果均无统计学意义(P>0.000 2)。

2.3基因-环境交互作用

自由度为1和2时交互作用分析所得的P值均小于0.05的前5位SNPs见表2，进行Bonferroni多重检验校正后，ACTN1基因的rs743127位点与被动吸烟的交互作用有统计学意义(P<0.000 2)。OR(case|G no E)为母亲孕期无被动吸烟时携带一个危险位点的患儿的OR值为0.59(95%CI:0.38～0.90)，OR(case|G and E)为患儿母亲孕期中有被动吸烟情况时携带一个危险位点的患儿的OR值为2.00(95%CI:1.23～3.26)。而基因-环境交互作用结果中P值较小的其他结果，如ACTN1基因的rs1475034、rs370535、rs2273419位点,CTNNB1基因的rs106871位点与被动吸烟(图2)和PVRL3基因的rs7634000、rs2971366、rs2634553、rs1489032、rs7624812位点与母亲孕期补充维生素(图3)的交互作用的P值并不具有统计学意义(P>0.000 2)。

3讨论

本研究针对806个中国汉族NSCL/P核心家庭，选取了细胞黏附相关8个基因进行了关联分析及基因-环境交互作用分析，研究发现经Bonferroni校正后，细胞黏附相关基因与NSCL/P之间的关联不具有统计学意义。而基因-环境交互作用分析发现经过校正后，ACTN1基因上的rs743127与被动吸烟之间的交互作用具有统计学意义。患儿母亲孕期有被动吸烟时携带一个危险位点的OR值大于母亲孕期无被动吸烟时携带一个危险位点的OR值，因此说明母亲孕期被动吸烟可增加子代患NSCL/P的风险。

ACTN1位于染色体14q24区域，ACTN1是角质细胞中表达的α辅肌动蛋白中的一个亚系。当角质细胞缺乏ACTN1的表达时，会改变细胞的肌动蛋白细胞骨架的构成，改变细胞极性，影响细胞伪足的运动性[17]。有研究表明，ACTN1基因突变与先天性巨血小板减少症有关，可能的机制为ACTN1通过影响α-辅肌动蛋白的形成而导致异常的细胞骨架结构[18]。本研究结果表明,ACTN1基因上的rs743127位点与被动吸烟的交互作用可能影响NSCL/P的发生，但目前没有研究表明ACTN1与NSCL/P之间存在关联。

有研究发现在携带CDH1基因突变的遗传性弥漫性胃癌病人中唇裂或腭裂的发病率较高[19-20]，唇腭裂与癌症发生之间存在关联，说明唇腭裂与癌症可能存在相同的病因，机制上可能是基因变异使细胞间黏附过程及细胞运动性受影响所致[21-22]。近年来，多个研究发现CDH1基因的rs16260、rs1801552位点与唇腭裂发生相关[5-7]。2014年，Bureau等[23]发现唇腭裂家族成员中CDH1存在罕见单核苷酸变异，以上研究结果表明CDH1基因可能影响唇腭裂的发生。PVRL1/2/3为脊髓灰质炎病毒受体相关基因，分别位于染色体11q23.3，19q13，3p22.1区域，属于免疫球蛋白超家族，参与上皮细胞的黏附过程，编码黏连蛋白，其主要作用是协同钙黏素调整上皮黏着连接形成的速度，影响上皮细胞的紧密连接形成[24]。研究表明，PVRL1在上腭的上皮细胞表达，且PVRL1基因突变参与综合征型唇腭裂的发生[25]。PVRL1也是非综合征型唇腭裂的候选基因，在委内瑞拉、美国、菲律宾及丹麦等多个人群研究中PVRL1突变与非综合征型唇腭裂存在相关[8-12]。然而，此结果并没有在中国汉族人群及巴西人群中发现[26-28]。2014年研究发现土耳其人群中PVRL1基因中GGA片段的插入与非综合征型唇腭裂有关[29]。

表2　基因-环境交互作用分析结果

SNP, single nucleotide polymorphism; MAF, minor allele frequency;LRT, likelihood ratio test; G, gene; E, environment.

图2　在条件Logistic回归模型中，考虑SNP效应及与环境的交互作用后ACTN1和CTNNB1的SNP在未暴露和暴露于被动吸烟的OR值，基因-环境交互作用的1个自由度和2个自由度的P值显示在X轴Figure 2　SNP×environmental tobacco smoke. Estimated OR(case|G no E) and OR(case|G and E) from conditional Logistic regression model considering SNP effects and their interaction with maternal exposure to environmental tobacco smoke on 806 NSCL/P case-parent trios for five SNPs in ACTN1 and CTNNB1. P-values from the 2 df and 1 df LRT for G×E interaction are shown along the X axis

图3　在条件Logistic回归模型中，考虑SNP效应及与环境的交互作用后PVRL3的SNP在孕期未补充维生素和补充维生素的OR值，基因-环境交互作用的1个自由度和2个自由度的P值显示在X轴Figure 3　SNP × maternal multivitamin supplementation. Estimated OR (case|G no E) and OR (case|G and E) from conditional Logistic regression model considering SNP effects and their interaction with maternal exposure to multivitamin supplementation on 806 NSCL/P case-parent trios for five SNPs in PVRL3. P-values from the 2 df and 1 df LRT for G×E interaction are shown along the X axis

本研究并未发现CDH1及PVRL1/2/3与NSCL/P之间存在关联可能由于以下几个原因：本研究同时分析226个基因位点，位点数目多，在同一样本中进行的检验次数也随之增多，由于存在多重比较的问题，使得假阳性率升高，本次研究使用Bonferroni法进行多重检验的校正，该方法假设每次比较之间是相互独立的，而基因位点之间是具有相关性的，因此使用该方法得出的结果比较保守；NSCL/P遗传位点的异质性、等位基因异质性等也可能对研究结果产生影响。不同的研究对环境因素暴露的定义和测量方法不一致、种族异质性、样本量大小不足等可能导致多项研究结果不一致。因此，在进一步的研究中可以统一环境暴露的定义、扩大样本量或者联合多项研究等方法探索基因-环境交互作用与NSCL/P的关联。

本研究优势为核心家庭设计可以较好地避免人群分层对研究造成的混杂,此种研究设计适用于早发疾病，可探索基因-环境交互作用。针对本病的发病率，此种设计类型把握度较高。但本次研究也具有如下的局限性,第一，核心家庭设计无法探索环境因素的独立危险效应。第二，本研究是在GWAS基础上进行的数据二次分析，由于GWAS只关注MAF大于1%的常见遗传变异位点，所以本次研究无法分析可能影响疾病发生风险的罕见遗传变异位点与NSCL/P的关联。

研究发现细胞黏附相关基因与唇腭裂的发生存在关联，但多项独立研究结果并不一致，可进一步在不同人群中开展细胞黏附相关基因的关联研究、基因-基因及基因-环境交互作用分析。已有研究表明，CDH1基因的rs16260位点与单纯腭裂存在相关[5]，但目前其他细胞黏附相关基因与单纯腭裂之间的关系并不明确，因此可在中国单纯腭裂患者中开展以上分析，更加深入地探索唇腭裂的发病机制，为预测其发病风险及制定预防措施提供科学证据。

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(2016-02-22收稿)

(本文编辑：刘淑萍)

Association study between candidate genes involved in cell-cell adhesion and non-syndromic cleft lip with or without cleft palate in Chinese population

YUAN Yuan1, WANG Ping2, WU-CHOU Yah-huei3, YE Xiao-qian4,5, HUANG Shang-zhi6, SHI Bing7, WANG Ke8, WANG Zhu-qing1, LIU Dong-jing1, WANG Zi-fan9,WU Tao1△, WANG Hong1

(1.Department of Epidemiology and Biostatistics, Peking University School of Public Health, Beijing 100191, China; 2. Department of Statistics and Information, Beijing Center for Disease Prevention and Control, Beijing 100013, China; 3. Department of Medical Research, Chang Gung Memorial Hospital, Taoyuan, Taiwan 33305, China; 4. Department of Pe-diatric Dentistry, Wuhan University School of Stomatology, Wuhan 430079, China; 5. Mount Sinai Medical Center, New York 10029, USA; 6. Department of Medical Genetics, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100005, China; 7. Department of Oral and Maxillofacial Surgery, State Key Laboratory of Oral Disease, West China College of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China; 8.Department of Oral Surgery,Qingdao University Medical College, Qingdao 266000, Shandong, China；9. Peking University School of Basic Medical Sciences, Beijing 100191, China)

ABSTRACTObjective： To explore the association and gene-environment interaction between single nucleotide polymorphisms (SNPs) involved in cell-cell adhesion and non-syndromic cleft lip with or without cleft palate (NSCL/P) among Chinese population. Methods: A total of 806 NSCL/P trios were drawn by an international consortium, which conducted a genome-wide association study (GWAS) using a case-parent trio design to investigate genes affecting risks to NSCL/P. The transmission disequilibrium test (TDT) was used to explore the association between cell-cell adhesion genes, including CDH1, CTNNB1, PVRL1, PVRL2, PVRL3, ACTN1, VCL, LEF1, and NSCL/P. Conditional Logistic regression models were used to estimate effects on risk of exposed and unexposed children. Four common maternal exposures including maternal smoking, environmental tobacco smoke, alcohol consumption and multivitamin supplementation during pregnancy were included in this study. Results: A total of 226 SNP markers were tested after quality control in this study. Although 23 SNPs in three genes (CTNNB1, CDH1, ACTN1) showed nominal significant association with NSCL/P in the TDT (P<0.05).There were no significant evidence of linkage and association that remained in the transmission disequilibrium test after Bonferroni correction(P>0.000 2). Tests for gene-environment interaction yielded significant results between rs743127 in ACTN1 and environmental tobacco smoke (P=0.000 1) with an estimated OR (case|G and E)=2.00(95%CI: 1.23-3.26) and OR (case|G no E)=0.59 (95%CI: 0.38-0.90). Among the lower P value results in gene-environment tests, there were no significant results between rs1475034, rs370535, rs2273419 in ACTN1, rs106871 in CTNNB1 and environmental tobacco smoke interaction. There were also no significant results between rs7634000, rs2971366, rs2634553, rs1489032, rs7624812 in PVRL3 and multivitamin supplementation during pregnancy in gene-environment tests(P>0.000 2). Conclusion: There is no association between cell-cell adhesion genes, including CDH1, CTNNB1, PVRL1, PVRL2, PVRL3, ACTN1, VCL, LEF1, and NSCL/P when the genes are considered alone. But our results suggest that SNPs in ACTN1 may influence the risk to NSCL/P through gene-environment interaction.

KEY WORDSACTN1; Cleft lip; Polymorphism, genetic; Genetic association studies; Gene-environment interaction

基金项目：国家自然科学基金(81573225)资助 Supported by the National Natural Science Foundation of China (81573225)

Corresponding author△’s e-mail, twu@bjmu.edu.cn

[中图分类号]R181.33

[文献标志码]A

[文章编号]1671-167X(2016)03-0403-06

doi:10.3969/j.issn.1671-167X.2016.03.005

网络出版时间：2016-5-1213：25：36网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20160512.1325.016.html