药物性肝病患者髓过氧化物酶基因多态性分析

姜月红，王燕颖.黑龙江省医院检验科，黑龙江哈尔滨　50036；.上海市东方医院消化内科，上海　000



药物性肝病患者髓过氧化物酶基因多态性分析

姜月红1，王燕颖2
1.黑龙江省医院检验科，黑龙江哈尔滨150036；2.上海市东方医院消化内科，上海200120

［摘要］目的探讨髓过氧化物酶（MPO）基因多态性与药物性肝病（DILI）之间的关系。方法病例采用对照分析的方法，方便收集37例药物性肝病患者和30例健康对照者外周血标本，提取DNA进行MPO-463G/A多态性检测。结果MP0-463 GG、GA和AA 3种基因型的频率在DILI组中分别为86.5％、10.8％和2.7％，在对照组中分别为73.4％、23.3％和3.3％；将携带MP0-463 GA和AA型者合并后与携带MPO-463 GG型相比较，患DILI的风险显著增高，相对于G等位基因，携带A等位基因的个体患DILI的风险显著降低，说明MP0-463 G/A多态性与DILI的发生有关。结论髓过氧化物酶基因多态性与药物性肝病易感性之间存在相关性，值得进一步研究。

［关键词］药物性肝病；髓过氧化物酶；基因多态性

药物性肝病（Drug-induced liver disease，DILI）是指由于临床治疗、营养或药物滥用所引起的肝细胞损伤性疾病，其发病机制复杂，主要与药物、个体差异和药物与机体的相互作用等方面相关，近几年关于诊断DILI没有特异性的诊断标准［1］。髓过氧化物酶（Myeloperoxidase MPO）是中性粒细胞嗜天青颗粒产生的氧化应激相关酶，能催化产生次氯酸能引起宿主DNA损伤［2］，MPO的基因具有多态性，不同基因型的个体MPO基因表达水平不同，导致个体对外源性物质易感性的差异，流行病学研究表明髓过氧化物酶（MPO）463G/A多态性与多种疾病相关。目前已在多种炎症和恶性肿瘤中观察到了MPO-463G/A基因多态性的作用，例如冠心病、大肠癌等疾病的易感性都与MPO-463G/A基因的多态性有关。该研究应用聚合酶链反应—限制片段长度多态性（PCR—RFLP）技术，对DILI患者与常规查体者进行基因检测及相关检查，采用病例—对照分析，旨在研究MPO基因多态性与DILI易感性之间的关系，为DILI的早期诊断和预防提供新的方法，现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料

方便选择2009年9月—2011年9月黑龙江省医院消化内科与传染科及健康体检者作为研究对象，分为DILI组、健康对照组。DILI组：37例，男11例，女26例，年龄25～68岁，平均（40.51±8.21）岁；研究入选标准［3］：①入组患者用药后，同时在1～4周内发生肝损害；②患者伴有皮疹、发热、瘙痒等过敏反应现象；③经检测末梢血嗜酸性粒细胞的水平＞0.06；④患者在临床上出现有肝内淤胆或者肝细胞损害的特征与病理变化；⑤MIT或者药物淋巴细胞转化实验结果呈阳性；⑥检测病毒性肝炎结果为阴性；⑦患者伴有药源性肝损害的病史，同时若是应用相同的药物可复发。

健康对照组：30例，其中男9例，女21例；年龄23～63岁，平均（41.23±9.01）岁，所有对象均无心、肝、肺等器官疾患，肝功能检测无异常。以上两组资料得到患者的同意，并通过伦理委员会的批准。在性别年龄构成差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2仪器和试剂

Tap DNA聚合酶购自日本Takara公司；限制性核酸内切酶A ci l购自美国NEB公司；PCR引物由上海博亚生物公司合成；凝胶图象扫描仪、Gene Amp 2400 PCR仪（美国ABI公司）。

1.3MPO基因多态性检测

1.3.1DNA提取1 mL新鲜血液离心去掉上层血浆后，加入红细胞裂解液至红细胞溶血完全，将离心沉淀后的悬液添加150 μL Solution I，应用旋涡混匀器震荡将其摇匀，时间约为10～25 s，保存在恒温65℃的条件下，约30 min。在向其加入约300 μL的Solution II进行混匀，同样在65℃条件下保存，离心后去上清液。并在上清液中加入250 μL无水乙醇。然后取得的溶液进行离心吸附柱，向其中加入500 μL的Solution III，进行离心后，弃用柱液。再向其中添加Eppendorf15 000 rpm于管中，同时进行离心，约3 min，且收集管。将所得的离心吸附柱放在一个1.5 mL的离心管中，再次杀菌，且加入60 μL EluteSolution，65℃孵育3 min，温度控制在65℃的左右，最后应用15 000 rpm离心，时间为1 min，把所收集的DNA保存在-20℃的冰箱中。

1.3.2PCR扩增依据NCBI GeneBank资料：MPO基因长11kb，位于17q23-q24，其中包含内含子11个、外显子12个，基因库注册号为M19508。PCR产物为350bp。扩增喊MPOG=463基因的PCR引物为下游5'-GCA ATG GTT CAA GCG ATT CTT C-3'及上游5'-CGG TAT AGG CAC ACA ATG GTG AG-3'。每25 μL PCR反应液中包含模板DNA100 μg，各种引物0.4 μmol/L、dNTP0.2 mmol/L，1.5 mmol/L MgCL21.0U以及Taq聚合酶、反应缓冲液等。于Gene Amp 2400PCR仪器中进行反应，反应条件为95℃变性2 min，94.2℃30 s，63.6℃30 s，72℃45 s，持续35个循环后温度降至72℃持续8 min。取5 μL PCR置入％琼脂糖凝胶中进行电泳分析，测定PCR产量。

1.3.3RFLP分析应用限制性内切酶Aci I分析MPO基因-463位点多态性反应体系如下：Buffer缓冲液2 μL，PCR产物8 μL，无菌去离子水9.5 μL，Aci I酶0.5 μL，总体积为20 μL。将上述各物质混匀后置于恒温水浴（37℃）中16 h左右。用2 μL Loading Buffer与上述酶切产物混匀，点于含0.5 g/mL EB的3.0％琼脂糖凝胶点样孔中电泳，于凝胶成像系统下进行观察并将实验结果拍照记录。

1.4统计方法

采用SPSS20.0软件统计进行分析研究，等位基因频率与组间基因型频率的资料对比应用Χ2检验、相对危险度分析、Logistic回归分析MP0基因463位点不同基因型在两组人群构成比以OR值和95％CI表示DILI发生危险性。

2　结果

如表1所示，以MPO-463位点GG型纯合子基因型为对照，携带MPO-463 GA型和单独携带MPO-463AA型在DILI组与对照组间差异均无统计学意义（P＞0.05）。将携带MP0-463GA型和携带MP0-463AA型合并后与携带MP0-463GG型比较，两组结果差异具有统计学意义（P＜0.05），同时两组检测到的G/A等位基因频率差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1　MPO基因分布与DILI的关系［n（％）］

3　讨论

DILI是一种自身免疫性疾病，多是药物和蛋白的共价结合形成免疫原性结合物（代谢产物和生物活性物质）［4］，通过抗原摄取、处理，而引起细胞增殖表达使机体肝脏受损，许多细胞因子也参与了反应。一般来讲，DILI是主要的诱导因素为药物不断的转化过程中多形成代谢物，而这些代谢产物一般都是细胞内部的较大分子物质，比如脂质、蛋白质等成分，它能够促使DNA破坏、脂质膜过氧化、蛋白功能紊乱等。一般多数病人停药后能够恢复，使得组织和临床上会发生相应的改变。有关数据表示［5］，由于国内外新药的不断使用，DILI发病率逐渐上升。目前，使用的髓过氧化物酶（MPO）属于一种介导的白细胞酶，MPO能够分泌反应性物质，从而作用影响机体自身的免疫功能，在生理状况下，可以很好的催化过氧化氢与氯离子进行反应，进而生成生成次氯酸。相关研究表示［6］，机体内的多种自由基会与其反应从而杀死病原微生物，因此，MPO可以参体内的免疫反应，同时改善机体的免疫系统使其发生作用。若是机体处于氧化应激或者炎症的时候，其催化所产生的物质会超过机体的抵抗呢你，成为负荷物质，进而会引起多种的组织损伤。MPO能够氧化巯基，致使细胞中的色素及血红蛋白失取活性，蛋白质进而降解，因此会很大程度的损伤肝细胞。而白细胞经过黏附、趋化、等作用在肝实质内被活化而渗出了血管壁，通过脱颗粒等一些物质刺激多种介质损伤血管内皮细胞和肺泡上皮细胞。

有关研究显示［7］，MPO作为一种氧化应激的的酶类，主要用于衡量机体组织氧化和代谢的指标。人工的MPO在加工的过程中，其基因位于染色体的17q23-q24上，主要有11个内含子和12个外显子构成［8］，Alu激素使其中一个SP-1转录结合位点的丧失，从而造成编码区上游463位点G突变A。该实验结果显示MP0-463 GG、GA和AA 3种基因型的频率在DILI组中分别为86.5％、10.8％和2.7％，在对照组中分别为73.4％、23.3％和3.3％，其中MP0-463GA型和携带MP0-463AA型合并后与携带MP0-463 GG型比较，两组结果差异有统计学意义（P＜0.05），同时两组检测到的G/A等位基因频率差异有统计学意义（P＜0.05）。说明MPO与DILI存在某种相关性，同时MPO也属于血红素辅基的血红素蛋白酶，作为细胞的氧化感受器，MPO的基因一般多数是以其他形态存在的，可以影响机体对疾病的敏感特异性。因此，MPO基因多态性与DILI易感性是呈现关联的关系。

综上所述，髓过氧化物酶基因多态性与药物性肝病易感性之间存在相关性，能够为临床方面的研究提供有价值的资料，也值得更进一步的研究。

［参考文献］

［1］陈海燕，赖江明，梁丽丽，等.髓过氧化物酶水平与急性冠脉综合征不良事件发生率的关系［J］.中国医学创新，2014 （11）：65-66.

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［5］吴越，于晓军.髓过氧化物酶及其多态性与疾病的研究进展［J］.免疫学杂志，2015（13）：95-98.

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Analysis of Myeloperoxidase Gene Polymorphism in Patients with Drug-induced Liver Disease

JIANG Yue-hong1，WANG Yan-ying2
1.Department of Clinical Laboratory，Heilongjiang Provincial Hospital，Harbin，Heilongjiang Province，150036 China；2.Department of Gastroenterology，Shanghai East Hospital，Shanghai，200120 China

［Abstract］Objective To discuss the correlation between the myeloperoxidase gene polymorphism and drug-induced liver disease. Methods The peripheral blood samples of 37 cases of patients with drug-induced liver disease and 30 healthy control people were collected according to the case control analysis method，and the MPO-463G/A polymorphism detection was carried out by extracting DNA. Results The genotype frequency of MP0-463 GG，GA and AA was respectively 86.5％，10.8％and 2.7％in the DILI group and 73.4％，23.3％and 3.3％in the control group；the risk of suffering from DILI in patients with MP0-463 GA and AA obviously increased compared with that of the patients with MPO-463 GG，the risk of suffering from DILI of individuals with A allele obviously decreased compared with that of the individuals with G allele，which indicated that MP0-463 G/A polymorphism was correlated with the occurrence of the DILI. Conclusion Myeloperoxidase gene polymorphism has a correlation with the susceptibility of drug-induced liver disease，which is worth further research.

［Key words］Drug-induced liver disease；Myeloperoxidase；Gene polymorphism

［中图分类号］R322.4+7

［文献标识码］A

［文章编号］1674-0742（2016）05（b）-0079-02

DOI：10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.14.079

收稿日期：（2016-02-12）