热补针法对RA模型家兔关节滑膜LDH、ATPase活性的影响*

杜小正,王金海,秦晓光,方晓丽,张小江

(1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000； 2.兰州大学第二医院，甘肃 兰州 730000)



·实验研究·

热补针法对RA模型家兔关节滑膜LDH、ATPase活性的影响*

杜小正1,王金海2,秦晓光1,方晓丽1,张小江1

(1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000； 2.兰州大学第二医院，甘肃 兰州 730000)

摘要目的：从机体能量代谢的角度探讨热补针法“取热”的作用机制。方法：将40只青紫蓝家兔随机分为正常对照组、模型对照组、平补平泻组、捻转补法组和热补针法组，每组8只。除正常对照组外，采用卵蛋白诱导法和低温冷冻法对其他4组进行RA寒证模型复制。造模成功后，除正常对照组、模型对照组外，其余各组分别施以平补平泻、捻转补法、热补针法针刺，留针30 min/次，1 d 1次，共7 d。治疗结束后分离关节滑膜，冰冻切片，借助组织化学染色技术观察膝关节滑膜组织乳酸脱氢酶(LDH)、三磷酸腺苷酶(ATPase)活性。结果：模型对照组LDH和ATPase积分光度、阳性总面积、面积百分比高于正常对照组，差别有统计学意义(P<0.05)；针刺组LDH活性变化均低于模型对照组(P<0.05)，而ATPase活性变化均高于模型对照组(P<0.05)；热补针法组LDH活性变化均低于其他两针刺组(P<0.05)，但ATPase活性变化明显高于其他两针刺组(P<0.05)。结论: 热补针法能够降低RA家兔关节滑膜LDH活性，增强ATPase活性，从而增强有氧代谢，使机体局部产生更多的能量可能是热补针法“取热”的机制之一。

关键词热补针法；类风湿关节炎；LDH；ATPase；动物；家兔

热补针法是简化烧山火和进火补法所形成的一种针刺手法，具有温阳散寒的作用，能使患者产生热感[1]。研究[2-4]表明：类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者存在能量代谢不足的现象，即轻中度贫血、四肢关节冰冷僵硬等。前期的研究[5-8]证实了热补针法对RA模型家兔具有镇痛效应，并且证实与脑脊液中β-EP、CCK-8和关节局部组织中β-EP、PGE2和LEK的变化有关。但是，这些研究只是从某些微观指标阐释了其机理，未能体现热补针法“取热”的特点，还不足以揭示热补针法对RA的相对特异调节机制。作为一种“取热”手法，是否调节了RA机体能量代谢，显示出相对特异性的治疗作用？因此，本实验以RA寒证模型家兔为载体，观察热补针法对能量代谢相关酶LDH和ATPase的影响，从调节机体能量代谢的角度探讨其作用机制。

1材料与方法

1.1动物

健康2.5月龄普通级雄性青紫蓝家兔40只，体质量(2.5±0.5)kg，由兰州生物制品研究所提供，合格证号SCXK(甘)2012-0001。动物购回后在兰州军区总医院实验动物中心(许可证号SYXK2007-007)饲养，饲养环境为：温度(20±2)℃，相对湿度(50±10)%，按昼夜节律自然照明，自由进食和饮水(自来水)，每周称量1次体质量。

1.2试剂与仪器

弗氏完全佐剂，Sigma公司产品，批号120428；卵蛋白干粉，上海伯奥生物科技有限公司产品，批号120513；硫化钠，上海化学试剂二厂产品，批号120511；LDH、ATPase染色试剂盒，上海榕柏生物技术有限公司产品，批号20120569。华佗牌针灸针，直径0.25 mm、长40 mm，苏州医疗用品有限公司产品；HANGPINGJAZO03精密天平，上海精密仪器公司产品；Tissue-Tek TEC全自动组织包埋机，产地日本；CM1900冰冻切片机，产地德国、OLYMPUS 51TR-32FB3-E01光学显微镜，产地日本。

1.3分组与模型的建立

动物被适应性饲养7d后，随机分为正常对照组、模型对照组、平补平泻组、捻转补法组和热补针法组，每组8只。以卵蛋白诱导法和低温冷冻法进行类风湿性关节炎寒证模型复制[9-10]，即：在实验开始的前3 d，用硫化钠和蒸馏水配制成的80 g/L硫化钠作为脱毛剂，脱掉家兔肩背部提前选定的6个点和双后腿膝关节周围的毛。将4 g/L的卵蛋白溶液和等量的弗氏完全佐剂混合液于每个点皮下注射0.2 mL。两周后再以同样的方法、剂量每点重复皮下注射1次。第2次免疫完成后6 d，将预先配制好的20 g/L卵蛋白生理盐水溶液向膝关节内分别注入0.4 mL。在24 h之内膝关节出现红肿触痛，表明模型复制成功。在模型复制成功后第2天，用700 mL/L酒精消毒两后腿足，上、下、左、右围置冰袋(3份冰+1份结晶氯化钙，粉碎混合，温度降至-20～-25 ℃之间)冷冻1.5 h，在45 ℃温水中复温5 min (室温12℃)。冷冻后14 d，家兔表现为精神萎糜不振；两后肢匍伏跛行；膝关节肿胀、周径明显大于对照组，局部青紫、皮温不高，表示RA寒证模型建立成功。

1.4针刺方法

造模成功后，各组家兔进行相应处理。足三里穴选取参照《实验针灸学》[11]家兔常用针灸穴位定位标准，并以比较解剖学为依据定位。正常对照组：不予任何处理，仅每日与针刺组同时给予捆绑和抓取刺激1次。模型对照组：不予任何处理，仅每日与针刺组同时给予捆绑和抓取刺激1次。平补平泻组：用兔台固定家兔，以质量分数20 g/L碘酒、体积分数750 mL/L酒精消毒后，将华佗牌针灸针90度直刺刺入足三里穴内8 mm，施以平补平泻法1 min，留针30 min/次, 1 d 1次，共7 d。平补平泻法操作方法参照《刺法灸法学》[12]：针刺得气后，施以前后均匀捻转，指力均匀，角度180°～360°，频率60～90转/min，反复操作1 min。捻转补法组：固定、消毒方法同前，将华佗牌针灸针90度直刺刺入足三里穴内8 mm，施以捻转补法1 min，留针30 min/次，1 d 1次，共7 d。捻转补法操作方法参照《刺法灸法学》[12]：针刺得气后，在针下得气处小幅度前后捻转针体(角度180°～360°，频率60～90转/min)，拇指向前左转时用力重，指力沉重向下；拇指向后右转还原时用力轻，反复操作1 min。热补针法组：固定、消毒方法同前，将华佗牌针灸针90度直刺刺入足三里穴内8 mm，施以热补法1 min，留针30 min/次，1 d 1次，共7 d。热补针法操作参照《郑氏针灸全集》[1]：操作者左手拇指紧按穴位，右手持针刺入穴内8～12 mm，针刺得气后，左手加重压力，右手拇指向前连续捻按5次；针下沉紧后针尖拉着有感应的部位，连续重插轻提5次；拇指再向前连续捻按5次，反复操作1 min，最后使针下沉紧，留针30 min。

1.5检测指标

采用组织化学染色法观察组织LDH和ATPase。

1.5.1组织切片制备

将家兔处死，迅速采取关节滑膜组织。恒冻箱切片机切片，厚度6 μm，贴于盖玻片上风干。ATPase采用钙钴法染色，LDH染色采用四唑盐法，严格按照染色试剂盒说明进行切片染色、制备。

1.5.2组织切片定量分析

组织切片经Image pro图像分析系统对关节滑膜细胞的LDH、ATPase阳性沉淀的图像分析。计算机软件分析[Pixel2]表示像素平方，主要用于计算酶染色阳性图像面积，Areasum[Pixel2]表示阳性总面积；面积百分比是关键性指标，表示阳性面积占整个图片百分数，反映酶相对活性强度；积分光度则是通过酶染色的深浅程度来体现酶活性的大小。

1.6统计学方法

2结果

2.1各组家兔关节滑膜LDH活性变化对比

模型对照组、平补平泻组、捻转补法组和热补针法组的家兔滑膜LDH积分光度、阳性总面积、面积百分比均高于正常对照组，差别有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组对比，平补平泻组、捻转补法组和热补针法组滑膜LDH积分光度、阳性总面积、面积百分比均降低，但仍高于正常对照组，差别有统计学意义( (P<0.05)。热补针法组LDH积分光度、阳性总面积、面积百分比均低于平补平泻组和捻转补法组，差别有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1。

注：与正常对照组对比，*P<0.05；与模型对照组对比，#P<0.05；与平补平泻组对比，△P<0.05；与捻转补法组比较，＊P<0.05。

2.2各组家兔关节滑膜ATPase活性变化对比

与正常对照组对比，模型对照组、平补平泻组、捻转补法组和热补针法组ATPase积分光度、阳性总面积、面积百分比升高，差别均有统计学意义(P<0.05)。平补平泻组、捻转补法组和热补针法组ATPase积分光度、阳性总面积、面积百分比均较模型对照组高，差别有统计学意义(P<0.05)。热补针法组ATPase活性高于平补平泻组和捻转补法组，差别有统计学意义(P<0.05)。见表2、图2。

注：与正常对照组对比，*P<0.05；与模型对照组对比，#P<0.05；与平补平泻组对比，△P<0.05；与捻转补法组对比，＊P<0.05。

3讨论

《针灸大成·三衢杨氏补泻》曰：“烧山火，能除寒，三进一退热涌涌……”又曰：“进火针，初进一分，……退三退，进三进，……自然热矣。”意即烧山火和进火补法均能使机体局部产生热感，因此称其为“取热”手法。热补针法是郑毓琳教授、郑魁山教授简化烧山火和进火补法而来的，具有“取热”效应。既然热补针法能够使机体局部产生热感，就说明机体的能量代谢发生了变化；因此，本实验选择与能量代谢相关的酶LDH和ATPase作为指标，观察其对RA寒证模型家兔能量代谢的影响。

卵蛋白诱导的RA模型能很好地模拟人RA病理过程，而且病理过程至少持续8周，在家兔等较大型动物上能够复制，是研究RA的理想的模型[13]。但是，卵蛋白诱导的RA模型关节局部始终红肿热痛，能量代谢异常活跃，类似于人RA发病早期的“热痹”。冷冻1次后，关节局部皮温逐渐降低，血沉加快，红细胞压积下降，纤维蛋白原增加，肢体血流缓慢，流量减少，与人RA后期的“寒痹”和“风寒湿阻证”相似[10]。前期的预实验观察发现，冻后第14天，皮温降至正常或者稍低，说明低温应激能使机体能量代谢下降。中医所谓“寒”就是低温环境刺激，这种单纯疾病动物模型过程中融入中医病因因素，既符合现代医学RA病理特点，又体现了中医辨证论治的特色。

LDH是糖无氧酵解的关键酶，广泛存在于组织细胞内，主要作用是催化乳酸与丙酮酸之间的反应。葡萄糖通过无氧酵解最后被LDH催化生成乳酸。机体在病理条件下，LDH活性增强，催化乳酸氧化，这是机体自动调节的保护性代偿机制。当滑膜组织缺氧时，滑膜细胞生理功能被破坏，发生一系列病理生化变化，滑膜细胞变性释放出LDH、细胞被破坏越多, LDH活性越强。本实验中模型对照组、平补平泻组、捻转补法组和热补针法组家兔滑膜LDH活性均显著高于正常对照组(P<0.05)印证了以上观点。此外，丙酮酸被LDH催化产生大量乳酸，乳酸在体内的大量堆积又会导致机体疲乏无力。本实验造模成功后，家兔精神萎靡、活动量减少的症状与之相符。针刺治疗1周后，平补平泻组、捻转补法组和热补针法组滑膜LDH活性均向正常水平恢复(P<0.05)，说明各种针刺方法均可使LDH活性降低，这可能是因为针刺可以增强局部血液循环，从而增强了供氧能力，使机体局部组织缺氧状态得到改善，细胞有氧呼吸增强，相应的无氧呼吸开始减弱，LDH活性也逐渐降低；且热补针法降低LDH活性的效果优于平补平泻法和捻转补法(P<0.05)。研究发现[14]疲劳大鼠骨骼肌中LDH含量明显增高(P<0.05)，通过服用抗疲劳中药能明显降低血清LDH[15]，这与本实验结果相似。ATPase是细胞膜上重要的离子载体，具有载体和酶的功能，可用于判断机体能量代谢的强弱。模型对照组ATPase活性增高，可能是因为低温应激使机体能量代谢下降，机体应激性增高了ATPase活性。针刺治疗后，ATPase活性进一步增高，说明这几种针刺方法均能使机体能量代谢能力增强，以热补针法的效应最明显。相似的研究[16]也表明针刺可以使小鼠胃及骨骼肌ATPase活性明显增强，与本实验结果相符。

LDH是无氧代谢酶，ATPase是有氧代谢酶，以上的结果提示：针刺能够降低无氧代谢而增强有氧代谢。热补针法可增强机体有氧代谢，使机体产生更多的能量，部分转化为热能散出体外，这可能就是热补针法“取热”的机制；但是机体能量代谢是一个涉及多个环节的复杂过程，仅从两个能量代谢相关酶的变化来得出上述结论为时过早，还需要进一步的深入研究。

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(编辑陶珠)

文章编号:1001-6910(2016)01-0058-05

中图分类号:R593.22

文献标志码:B

doi:10.3969/j.issn.1001-6910.2016.01.26

作者简介

杜小正(1973-)，男(汉族)，甘肃兰州人，博士，副教授，副主任医师，研究方向：传统针刺手法治疗免疫系统疾病。

* 基金项目：2011年度甘肃省教育厅第二批科研项目(1106B-08)；2010年度甘肃中医学院中青年科研基金项目(gszyxy2010-4)

收稿日期：2015-06-18；修回日期：2015-11-11