重组人白细胞介素-11对雌激素周期性小鼠阴道上皮细胞有丝分裂和PCNA表达的影响

曹立军，王进

(1.山东大学齐鲁医院 急诊内科，山东 济南 250012；2. 山东大学医学院 药理学系，山东 济南 250012)

重组人白细胞介素-11对雌激素周期性小鼠阴道上皮细胞有丝分裂和PCNA表达的影响

曹立军1，王进2Δ

(1.山东大学齐鲁医院 急诊内科，山东 济南 250012；2. 山东大学医学院 药理学系，山东 济南 250012)

目的 研究重组人白细胞介素-11(rhIL-11)对小鼠阴道上皮细胞有丝分裂和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)表达的影响。 方法 采用雌激素周期性小鼠阴道上皮增殖银屑病实验模型及PCNA免疫组化方法, 测定白细胞介素-11对小鼠阴道上皮细胞有丝分裂和PCNA表达的影响。 结果 白细胞介素-11可显著抑制小鼠阴道上皮细胞有丝分裂(P<0.01)，并显著抑制PCNA的表达(P<0.01)。结论 白细胞介素-11可明显抑制上皮细胞有丝分裂和PCNA的表达，对银屑病等表皮过度增殖性异常病变有较好的防治作用。

重组人白细胞介素-11；银屑病；有丝分裂；增殖细胞核抗原

银屑病是一种常见的自身免疫性炎症和慢性增殖性皮肤病，主要组织病理表现可见表皮内角朊细胞增生周期变短、进入增殖期的细胞异常增多[1-2]。重组人白细胞介素-11(recombinant human interleukin -11，rhIL-11)系通过基因重组工程而制得的具有高活性的生物制剂，对机体无明显不良反应，是一种多效性细胞因子[3-4]，具有抑制表皮异常增殖的调节作用[5]。研究前期发现其对角朊细胞分化不全有改善作用[6]，但其对银屑病模型中细胞过度增殖的影响尚无研究报道。本研究通过皮下注射(sc)rhIL-11，观察其对实验性银屑病模型小鼠的阴道上皮细胞有丝分裂的影响，并采用免疫组化法测定增殖细胞核抗原(PCNA)在阴道上皮细胞中的表达，旨在分析认识银屑病发展的分子调节机制，对开拓寻找防治此类疾病的高效新药具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：昆明种雌性健康小白鼠60只，平均体质量(23±2)g，山东大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK(鲁)2013 0009。

1.1.2 药品与试剂：重组人白细胞介素-11(齐鲁制药厂, 批号：20120301)；甲氨喋呤(MTX)(上海华联制药有限公司生产，批号：130201A)；己烯雌酚(上海通用药业股份有限公司，批号：120503)；秋水仙碱(云南植物药业有限公司,批号：20110301)；小鼠PCNA单克隆抗体及试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司提供，批号：BM0114)。

1.1.3 实验仪器：L8-80型低温超速离心机(Beckman公司，美国)；BH-2型光学显微镜(OLYMPUS公司，日本)；恒温水浴箱(上海医疗器械三厂)；石蜡切片机(AO spencer公司，美国)；切片漂烘温控仪(安徽电子科学研究所)；MPIAS-1000图像分析系统(北京华海公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组与给药方法：取昆明种雌性小鼠60只，随机分为5组，即空白组、模型组、阳性对照甲氨喋呤组(MTX 1.5 mg/kg)、rhIL-11高、低剂量组(1.5 mg/kg，0.375 μg/kg)。除空白组ip (腹腔注射)NS 0.9%氯化钠溶液外，其余各组均ip己烯雌酚0.2 mg/只，qd(每天1次),连续3 d，3 d后隔天1次ip己烯雌酚,并各组同时SC (皮下注射)给予相应受试药物，空白组和模型组 SC等量NS， 1次/天给药，共12 d。第12天上午各组均注射秋水仙碱2 mg/kg(使细胞有丝分裂停滞在有丝分裂中期，以便进行观察计数)，6 h 后处死动物并解剖取阴道组织。各组动物在给药前和用药后每周称重1次。

1.2.2 检测指标与观察方法

① 对动物体质量变化的影响：在给药前、给药第6天、12天分别测量体质量，观察变化。

② 药物对小鼠阴道上皮细胞有丝分裂的影响：取小鼠阴道组织，10%福尔马林固定，常规HE染色。在光学显微镜下观察计数300个基底细胞中有丝分裂的细胞数，然后算出各给药组有丝分裂指数(每100个基底细胞中出现有丝分裂的细胞数)。

③ 药物对小鼠阴道上皮PCNA表达的影响：严格按照试剂盒说明进行操作，免疫组织化学方法检测阴道上皮组织中PCNA的表达。采用链霉亲合素-生物素-过氧化物酶复合物法进行。

④ PCNA的免疫组化检测方法：在20×20光镜下，以阳性染色的单个上皮细胞簇为一个阳性标记，每例观察切片1张，于丰富区随机选取5个相互非重叠视野进行观察。采用双盲方式在光学显微镜下观察。每组切片中以PBS缓冲液代替一抗进行反应的染色均为阴性着色。

⑤ 定量分析：将免疫组织化学染色结果输入图像分析系统 (MPIAS 1000),每张切片随机选择5个不同的视野，经屏分割和滤波等处理，分别测量各组切片中阳性部位的相对含量(灰度值)，根据公式：OD=Log(空白灰度/标本灰度)计算出平均光密度(MOD)值和S值，结果用平均光密度表示。

2 结果

2.1 rhIL-11对小鼠体质量的影响 结果表明，rhIL-11在用药过程中，小鼠体质量变化不大，与模型组比较差异无统计学意义，说明药物对小鼠生长无明显不良影响。而MTX在1.5 mg/kg时，在药后第6天和第12天明显降低小鼠体质量，与模型组比较差异有统计学意义。见表1。

表1 rhIL-11对小鼠体质量的影响

*P<0.05，与模型组比较，compared with model group

2.2 rhIL-11对雌性小鼠阴道上皮细胞有丝分裂的影响 结果表明，模型组与空白组相比，阴道上皮细胞有丝分裂指数差异有统计学意义(P<0.01)，说明造模成功。同时可看出rhIL-11各剂量组和甲氨喋呤均可抑制小鼠阴道基底细胞的有丝分裂，与空白组比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 rhIL-11对雌激素周期性小鼠阴道基底细胞有丝分裂和PCNA表达的影响

**P<0.01, 与模型组比，compared with model group；##P<0.01，与空白组比，compared with control group

2.3 rhIL-11对阴道上皮细胞增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响 应用免疫组织化学方法检测发现，模型组小鼠有明显的PCNA阳性染色高度表达，rhIL-11高剂量组和MTX组仅有PCNA轻度表达，阳性反应部位主要以基底细胞核为主，表现为棕黄色深染(见图1)。将各组免疫组织化学染色结果输入图像分析系统(MPIAS 1000)分析平均光密度。rhIL-11高剂量组和MTX组与模型组相比，PCNA表达明显减少(P<0.01，见表2)。

图1 rhIL-11对雌激素周期性小鼠阴道上皮细胞PCNA表达的影响(×400)Fig.1 Effect of recombinant human interleukin-11 on the exprssion of PCNA of vaginal epithelial cells in estrone periodical mice(×400)

3 讨论

银屑病是一种增生性皮肤病，主要的病理特征为表皮过度增生、分化不良、伴有炎症细胞浸润。银屑病角朊细胞动力学研究发现表皮内角朊细胞增生周期变短、进入增殖期的细胞增多[1-2]。PCNA是真核细胞DNA合成所必需的一种核蛋白，存在于增生活跃的细胞中，在G1后期和S期表达。雌激素化的小鼠阴道上皮处于增殖状态，用PCNA标记可从分子水平真实反映其增殖程度的变化，PCNA是石蜡切片上反映细胞增殖的主要指标之一[7]，银屑病患者表皮PCNA表达增强[8]。PCNA在表皮细胞异常增殖中的作用可能与促使非增殖期的角朊细胞大量进入增殖周期有关[9]。本研究将PCNA的过度表达作为银屑病实验模型的主要指标之一，同时计算细胞的有丝分裂指数，以观察药物对细胞过度增殖的影响。PCNA的检测采用链霉亲合素-生物素-过氧化物酶复合物法进行。基本原理为用特异性抗体与标本中抗原结合后，再用生物素标记的抗体结合于特异性抗原之上，再加入SABC复合物，通过链霉亲合素上的结合位点与标记在物素结合，最后加入底物DAB，通过过氧化物酶催化显色。

在实验中可见到雌激素化小鼠阴道上皮PCNA表达明显，基底层细胞和棘层细胞均有活跃表达，应用rhIL-11治疗后则明显下降，阳性治疗对照组注射MTX后PCNA表达更弱。可见MTX通过抑制免疫系统和叶酸还原酶，明显阻止表皮细胞增殖时DNA合成，抑制细胞核的有丝分裂和过度增殖[10]。rhIL-11高剂量应用对小鼠阴道上皮PCNA的表达有明显抑制作用，其结果与对小鼠阴道上皮有丝分裂的影响完全一致，更进一步证实了rhIL-11具有抑制表皮异常增殖的作用[5]，这可能与其诱导细胞周期阻滞及抑制细胞生长分化有关[11]，而且rhIL-11作为多效性因子，除促进造血外还可调节多种细胞因子和抑制自身免疫等[3-4]。

有报道PCNA作为药效学研究的指标可能比常规组织学方法更为直观和可靠[12-13]，本研究结果亦可证明这一点。本研究中rhIL-11未出现明显的不良反应，对体质量变化影响不大，1.5 mg/kg的 rhIL-11可使小鼠体质量呈增加趋势，但与模型组相比，差异无统计学意义。而MTX 1.5 mg/kg则使动物体质量明显下降，与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。说明连续应用rhIL-11对小鼠生长无明显不良影响。rhIL-11系通过基因工程技术重组的高活性生物制剂，对机体无明显不良反应[14]。MTX虽对银屑病有较强的治疗作用，但因明显的副作用(如肝纤维化，肝硬化等)而限制其临床应用。

进一步探讨rhIL-11对银屑病动物模型中其它细胞因子的影响，对于深入认识银屑病等自身免疫性疾病的分子发生机制，开拓寻找防治此类疾病的无交叉机制及副作用小的高效药物具有重要的意义。

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(编校：王冬梅)

Effects of recombinant human interleukin-11 on the vaginal epithelium mitosis of estrone periodical mice and the expression of PCNA

CAO Li-jun1, WANG Jin2Δ

(1. Department of Emergency, Qilu Hospital of Shandong University, Ji’nan 250012, China;2.Institute of Pharmacology, Shandong University School of Medicine, Ji’nan 250012, China)

ObjectiveTo investigate the therapeutic effects of recombinant human interleukin-11 (rhIL-11) on the vaginal epithelium mitosis of estrone periodical mice and the exprssion of PCNA. MethodsThe vaginal epithelium mitosis of estrone periodical mice was used as the epidermis hyperplasia model, rhIL-11 action in regulating the epidermis hyperplasia was observed and the expression of PCNA was detected by immunohistochemistry. ResultsThe rhIL-11 significantly inhibited the mitosis of mouse vaginal epithelium, decreased the expression of PCNA(P<0.01). ConclusionThe rhIL-11 has good efficacy in treating the epidermis hyperplasia of psoriasis by inhibiting the mitosis of epithelium and decreasing the expression of PCNA.

recombinant human interleukin-11; psoriasis; mitosis; PCNA

山东省科技发展计划项目(2007GG3WZ02059)

曹立军，女，博士，副主任医师，研究方向：心脑血管及抗炎免疫疾病，E-mail:csq44@sina.com；王进，通信作者，男，博士，讲师，研究方向：心脑血管及抗炎免疫疾病，E-mail：wjjinan@163.com。

R967

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.04.12