患者HPA 1-6，9，15基因多态性对血小板输注无效的临床意义

李园，曾惠， 吴海兵，赵晓燕，颜敏超，郭晓

(嘉兴市第一医院 血液科，浙江 嘉兴 314001)

患者HPA 1-6，9，15基因多态性对血小板输注无效的临床意义

(嘉兴市第一医院 血液科，浙江 嘉兴 314001)

目的 观察人类血小板特异性抗原(human platelet alloantigens， HPA)1-6，9，15系统及其基因多态性与血小板输注无效(platelet transfusion refractoriness， PTR)的研究。方法 选取40例血小板输注无效患者的外周血标本和供者标本，对其进行血小板特异性糖蛋白抗体检测，根据血小板回收率评判血小板输注效果，采用聚合酶链式反应(PCR)结合直接测序方法，对供、患者进行HPA1-6，9，15抗原系统基因进行分型，动态观察患者同型血小板输注后血小板恢复百分率(percent platelet recovery，PPR)，探讨HPA基因多态性和血小板输注无效的关系。结果 患者和供者HPA-1、4、9均未检测出HPA-b基因，呈呈aa纯合子单态性分布；HPA-5、6则主要以aa纯合子为多，较少看到bb纯合子。而HPA-2、3、15呈明显多态性分布，HPA-2、3、5、6、15等位基因频率均呈多态性分布。结论 对反复多次发生血小板输注无效的患者，除需考虑HLA基因相关外，还与HPA基因多态性相关。在做HPA配型时，多数人只需检测供者与患者HPA2、3、15基因就可以显著减少血小板输注无效的发生。

血小板特异性抗原；基因多态性；血小板输注无效；血小板恢复百分率

人类血小板特异性抗原(human platelet alloantigens， HPA)是血小板糖蛋白携带的一类特异性抗原，其主要表达于血小板膜糖蛋白上[1]。血小板膜糖蛋白基因迄今为止已有22中，这些基因具有单核苷酸多态性(SNP)[2]，从而导致HPA的多态性。且HPA基因频率与种族、地域等关系密切[3]。若HPA不合则会导致机体产生血小板同种抗体进而引起免疫反应导致血小板损伤。其与输血过程中可能出现的血小板输注无效(PTR)、输血后紫癜(PTP)等直接相关[4]。PTR是指临床上应用血小板输注进行治疗时，患者血液内的血小板计数增加值显著低于临床预期或者患者再次出血现象甚至会由于血小板的破坏而危及生命[5]。血小板输注是目前治疗血小板减少及预防出血的主要方法，但可能会产生PTR，达不到理想的治疗效果[6]。有研究表明[7]，引起PTR的主要为人类白细胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)，但是HPA引起的PTR的严重程度显著高于HLA。而引起PTR的HPA系统主要集中在HPA1-6，9，15[8]中。因此，本次研究主要集中于以上几个系统。

为了对HPA1-6，9，15的基因多态性与PTR的发生情况进行研究，本次选取了40例PTR患者及供者作为研究对象，通过PCR和直接测序的方法对研究对象的外周血标本进行检测，对HPA抗原系统进行分型，明确PTR与HPA抗原系统基因的联系，为临床合理治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取于2015年1月～2015.6来嘉兴市第一医院就诊的血小板输注患者40例，年龄23～84岁，平均年龄(45±17)岁，其中男性19例，女性21例。病例中包括免疫性血小板减少性紫癜16例，白血病16例，再生障碍性贫血4例，骨髓增生异常综合症患者3例，巨球蛋白血症1例。所有患者均符合临床血小板输注无效的诊断。纳入标准：①经临床诊断及辅助检查确认为血小板输注无效患者;②HIV抗体阴性患者;③排除了患者与供者由于HLA类抗体导致的PTR；排除标准：①弥散性血管内凝血(DIC)、败血症、脾肿大及输注前后6 h体温38.5者;②血小板输注前24 h服用两性霉素B、万古霉素者及输注前1个月内输注静脉免疫球蛋白者;③在检测血小板输注后24 h PPR之前又输注其他血液者。供血者来源于嘉兴中心血站提供的血液样本。所有患者及其家属均知情同意并签署了知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器及试剂：HPA Ready Gene Plus 试剂盒(德国 inno-train 公司)；DNA提取试剂盒(德国QIAGEN公司)；Taq酶(Promega 公司)；PCR扩增仪(美国ABI9700)；ELX型通用酶标仪(美国Bio-Tak公司)；低温高速离心机(BECKMAN 64R)，凝胶成像仪(美国 Bio-Rad)，琼脂糖凝胶电泳仪(江苏盛蓝仪器制造有限公司)。

1.2.2 实验步骤：取患者外周静脉抗凝血5 mL，按照QIAGEN公司的DNA提取试剂盒说明书进行微注法DNA的提取，测定其浓度。根据HPA1-6，9，15系统的基因序列设计相应的引物并进行PCR扩增，扩增条件为94 2 min 进行变性，94 ℃ 15 s、65 ℃ 60 s进行10个循环，94 ℃ 15 s， 61 ℃ 50 s，72 ℃ 30 s的条件进行20个循环，4延伸15 min。取PCR扩增产物5 μL进行2%琼脂糖凝胶电泳，并于紫外凝胶成像仪中进行分析。对所有合格的PCR产物进行直接测序，并与HPA1-6，9，15系统的基因序列进行比对，尽可能挑出覆盖HPA1-6，9，15系统抗原的血小板细胞。

1.2.3 血小板输注疗效判定标准：临床上一般用血小板恢复百分率(PPR)和输注后血小板计数纠正增加指数(CCI)作为血小板输注效果评价指标[9]。输注24 h后，若PPR20%或者CCI<10则认为血小板输注无效(PTR)[10]。

2 结果

2.1 患者与供者HPA 1-6，9，15 抗原相合与否与发生PTR的临床观察 对40例输注无效的患者和36名健康献血者进行HPA1-6，9，15抗原分型及匹配，结果发现40例发生PTR的患者中，有39例患者与供者的HPA分型不合，占97.5%，显著高于患者与供者HPA分型相合时发生的PTR比例(2.5%)，且差异具有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 供患双方HPA分型情况与临床PTR发生率的相关性比较

**P<0.01，与HPA分型不合患者相比，compared with for both sides with HPA classification incompatibility

2.2 患者与供者HPA系统中基因的多态性分布 对患者和供者的HPA1-6，9，15系统及其基因分布进行分析研究，PCR结果见图1、图2。

图1 患者HPA1-6，9，15基因检测结果Fig.1 Results of patient HPA1-6, 9, 15 gene test

图2 供者HPA1-6，9，15基因检测结果Fig.2 Results of donor HPA1-6, 9, 15 gene test

对PCR结果进行统计分析发现，患者与供者的HPA 1、4、9均未发现HPA-b基因，均呈aa纯合子单性态分布；HPA 5、6则主要以aa纯合子为多，极少能够发现bb纯合子；HPA2、3、15则呈现明显的多态性分布。且HPA 2、3、5、6、15等位基因频率均呈现多态性分布，其中，HPA 3、15的杂合度最高，而b等位基因的频率则以HPA 15 为最高(0.569)，其次为HPA 3(0.458)和HPA 2(0.097)。具体结果见表2、3。

表2 患者HPA 1-6，9，15等位基因分布情况

表3 供者HPA 1-6， 9， 15等位基因分布情况

综上分析，HPA1-6，9，15等位基因中，HPA2，3，15呈现出较明显的基因多态性分布情况，若在输血过程中仅关注血型的匹配，则极有可能因这些基因的多态性分布而导致患者产生严重的血小板输注无效的情况，若能很好的控制供患双方这些基因的匹配度则可能极大的减少血小板输注无效的发生率，具有极强的临床意义。

3 讨论

血小板输注是临床上治疗血小板减少和预防出血的重要方法，但是其可能会导致血小板输注无效(PTR)。导致PTR的原因有多种，包括自身免疫性疾病、部分抗生素的使用、ABO血型抗原、HLA抗体、HPA抗体等[11]。在我国大部分地区，对患者进行输血时仅考虑了ABO血型这一因素[12]，因此临川上血小板输注效果并不理想。研究发现，在免疫性致病因素中，HLA占80%，HPA因素占11.7%[13]，2者约占所有病因的16.2%，不容忽视，而HPA不匹配导致的PTR反应可能会更严重。HPA不合的输注可以导致机体产生血小板同种的抗体从而引起血小板破坏，并且不合度越高，产生PTR的严重程度越高[14]。临床上在进行血小板输注的时候，选择与患者HLA和HPA均匹配的血小板或许是减少发生PTR的有效方法之一。

为了研究HPA1-6，9，15系统中基因多态性对血小板输注无效的临床意义，本研究选取了血小板输注无效患者，采用PCR和直接测序相结合的方法对患者和供血者外周血进行测试，并对HPA1-6、9、15系统等位基因进行分型。研究结果发现，PTR患者中HPA分型不合占97.5%，显著高于HPA分型相合的患者(2.5%)，从一定程度上提示患者和供血者的HPA分型相合有助于减少PTR的发生率。对HPA1-6、9、15系统等位基因多态性的分布中发现，患者和供者血清中HPA 2、3、15呈现出较明显的多态性分布，且HPA 2、3、5、6、15等位基因频率均呈现多态性分布，其中，HPA 3、15的杂合度最高，这也与其他一些研究相符合[15-16]，提示：这些系统基因分布的不合的比例很高，很可能是造成PTR产生的重要原因。

综上所述，在进行血小板输注时，除需考虑ABO血型相匹配外，HLA和HPA基因的匹配也应纳入选择标准，而做HPA配型时，多数患者只需检测供者和受者的HPA2 、3、15基因即可显著减少血小板输注无效的发生。这样既可以减少成本又能够提高治疗效率。但是，本次研究纳入的研究对象仅有40例，并且仅局限于一个地区，由于HPA在人群中的分布情况与地域、人种等均有较密切的关系，因此还需纳入更多的研究样本进行分析才能得出更加准确的结论，为临床治疗提供有效的参考数据。

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(编校：谭玲)

Research on the clinical value between gene polymorphism of HPA 1-6,9,15 and platelet transfusion refractoriness

LI Yuan， ZENG Hui， WU Hai-bin， ZHAO Xiao-yan， YAN Min-chao， GUO Xiao-junΔ

(Department of Hematology, The First Hospital of Jiaxing, Jiaxing 314001, China)

ObjectiveTo research the clinical value between gene polymorphism of human platelet alloantigens (HPA) 1-6, 9, 15 and platelet transfusion refractoriness (PTR). MethodsTotally 40 patients with platelet transfusion refractoriness(PTR) were randomly selected, and patients and donors’ peripheral blood specimens were collected and tested these samples with platelet GP specific antibodies, and judged the results of platelet transfusion, and with the help of the combination of PCR and direct sequencing for classification of HPA 1-6,9,15 antigens and observe the percent platelet recovery(PPR) after the same type of platelet transfusion, and explore the relationship between HPA gene polymorphism and PTR. ResultsThere was no HPA-b gene was found neither on patients and donors’ HPA 1,4,9, showed the distribution of aa homozygous form; HPA 5,6 were mainly aa homozygous form, little bb homozygous form was discorvered. And HPA 2,3,15 were distributed of polymorphism, the frequency of HPA 2,3,5,6,15 were found with polymorphism. ConclusionFor these patients who were happened with PRT many times, in addition to taking HLA into account, HPA gene polymorphism are also need to be considered. Most people only need to test patients and donors’ HPA2,3,15 gene to decrease the occurrence of PTR significantly when making HPA matching.

human platelet allogntigens; gene polymorphism; platelet transfusion refractoriness; percent platelet recorvery

浙江省嘉兴市科技计划(2013AY21042-8)

李园，女，本科，主治医师，研究方向：血小板抗体与输血，E-mail：anne_263@sina.com；郭晓珺，通信作者，女，本科，主任医师，研究方向：血小板抗体与输血，E-mail：jxzzxgxj@163.com。

R475.11

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.04.55