问号钩端螺旋体colA基因产物胶原酶活性及其致病机制研究

赵金方，谈潘莉，汪浙炯，胡玮琳，严　杰，Kokouvi Kassegne



问号钩端螺旋体colA基因产物胶原酶活性及其致病机制研究

赵金方1，谈潘莉1，汪浙炯1，胡玮琳2，严杰2，Kokouvi Kassegne2

1.浙江中医药大学附属第一医院检验科，杭州310006；2.浙江大学医学院病原生物学系，杭州310058

摘要：目的了解不同问号钩端螺旋体(简称钩体)血清群colA基因分布和序列保守性、表达产物胶原酶活性以及感染细胞时colA基因表达水平变化和产物分泌情况。方法采用PCR及其产物测序法检测我国主要流行的7个问号钩体血清群代表株中colA基因并了解其序列保守性。构建问号钩体黄疸出血群赖型赖株colA基因原核表达系统，Ni-NTA亲和层析法提取表达的目的重组蛋白rColA。采用分光光度法检测rColA水解I～IV型天然胶原蛋白及Azocoll和Pz-肽合成底物能力并测定其Km和Kcat值。采用实时荧光定量RT-PCR和Western Blot分别检测问号钩体赖株感染HUVEC、BEAS-2B、L-02、HEK293细胞时colA-mRNA水平变化及ColA分泌情况。结果不同血清群问号钩体均能扩增出全长colA基因片段，其核苷酸和氨基酸序列相似性高达99.4%～100%。所构建的colA基因表达系统能有效表达rColA。rColA能不同程度地水解上述6种底物，但水解III型胶原蛋白能力最强(P<0.05)，其Km和Kcat值分别为2.16 mg/mL和35.6 h-1。问号钩体赖株感染各靶细胞时colA-mRNA水平显著升高(P<0.01)，问号钩体-细胞共培养物上清中可检出ColA。结论问号钩体colA基因为序列保守、分布广泛的胶原酶编码基因，感染细胞时该基因产物表达上调并外分泌，从而在问号钩体感染宿主过程中发挥实际作用。

关键词：问号钩端螺旋体；colA基因；胶原酶；表达；分泌

Supported by the grants from the National Natural Science Foundation of China(Nos. 81261160321 and 81171534) and a grant from the Provincial National Natural Science Foundation of Zhejiang Province(No. LQ14H190001)

致病性钩端螺旋体(简称钩体)感染引起的钩体病是全球流行的人兽共患传染病[1]。致病性钩体有7个基因种(genospecies)，但以问号钩体(Leptospirainterrogans)流行最广[1-3]。动物感染问号钩体后症状轻微，但可持续从尿液排出钩体污染水源和土壤，人接触疫水或疫土后均发病[3-4]。问号钩体能迅速穿越人皮肤或黏膜并侵入血流引起钩体血症，继而播散至肺、肝、肾等脏器，部分恢复期病人可有尿液排菌[3-5]。尽管问号钩体有强大的侵袭力，但其侵袭因子及作用机制了解甚少。

胶原酶是病原菌重要的侵袭性毒力因子，可降解宿主结缔组织及胞外基质中的胶原蛋白[6-8]。问号钩体黄疸出血群赖型赖株基因组中有一个称为colA的胶原酶基因[9-10]，但其产物功能尚未证实。本研究检测了我国主要流行的问号钩体血清群中colA基因分布并进行了序列分析，构建了问号钩体赖株colA基因原核表达系统并检测了重组表达产物rColA胶原酶活性及酶动力学特性，以及感染细胞后colA基因表达及其产物外分泌情况，以期为深入研究问号钩体ColA致病机制奠定基础。

1材料与方法

1.1钩体与细胞株来源及培养问号钩体黄疸出血群赖型赖株、流感伤寒群流感伤寒型临6株、秋季群秋季型临4株、波摩那群波摩那型罗株、七日热群七日热型P7株、澳洲群澳洲型65-9株、犬群犬型Lin株由北京中国药品生物制品研究院提供，人HUVEC脐静脉内皮细胞、BEAS-2B肺上皮细胞、L-02肝细胞和HEK293肾上皮细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。问号钩体用EMJH培养液28 ℃培养[11]，细胞株用10%胎牛血清(FCS)dmem或RPMI-1640培养液(GiBco)37 ℃培养。

1.2PCR采用细菌DNA提取试剂盒(Axygen)提取上述问号钩体基因组DNA，紫外分光光度法测定其浓度[12]。根据GenBank中问号钩体赖株colA基因序列(accession No.NC_004342)及其限制性核酸内切酶位点分析结果，设计携带NdeI和XhoI核酸内切酶位点PCR引物。上游引物：GAG CAT ATG(NdeI) CAA AAT AAT GGC TCT AAA-3′，下游引物：GAG CTC GAG(XhoI) GAA ATT ACA ACT TGA ATT CGC-3′。以100 ng问号钩体DNA为模板，采用PCR扩增无信号肽序列的colA基因片段(2 589 bp)，反应参数：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 180 s，30个循环；72 ℃ 15 min。扩增产物经溴乙锭预染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳检查后，采用T-A克隆试剂盒(TaKaRa)将其克隆入pMD18-T中形成重组质粒pMD18-TcolA，委托上海Invitrogen公司测序。采用BLAST软件比对不同血清群问号钩体colA基因的核苷酸和氨基酸序列相似性[13]。

1.3colA基因原核表达系统构建及鉴定问号钩体赖株pMD18-TcolA与原核表达载体pET42a(Novagen)用NdeI和XhoI(TaKaRa)双酶切，回收目的条带后用紫外分光光度法测定其浓度[12]。300～500 ng的colA基因片段与100 ng线性化pET42a混合，在T4 DNA连接酶(TaKaRa)作用下形成重组表达载体pET42acolA。采用CaCl2法将pET42acolA转化入表达宿主菌E.coliBL21DE3(Novagen)中形成工程菌株E.coliBL21DE3pET42a-colA [12]。该菌株接种于含50 μg/mL卡那霉素(Kan)LB平板(Oxoid)上37 ℃培养18 h，挑取白色菌落在Kan-LB培养液中37 ℃振荡培养4～6 h增菌，用细菌质粒提取试剂盒(Axygen)提取pET42acolA后再次测序。

1.4rColA表达与提纯E.coliBL21DE3pET42a-colA接种于Kan-LB培养液(Oxoid)中，30 ℃振荡培养2 h，加入0.5 mmol/L IPTG(Sigma)，30 ℃振荡培养4～6 h，以诱导rColA表达。细菌超声裂解后12 000 r/min 4 ℃离心30 min，取上清采用Ni-NTA 亲和层析柱(BioColor)提取表达的rColA，BCA蛋白定量试剂盒(Beyotime Biotech)和SDS-PAGE分别检测其浓度和纯度[12]。

1.5兔抗rColA血清及其IgG制备1 mg rColA与等体积弗氏完全佐剂混匀，间隔1周背部皮下多点注射免疫家兔4次，末次免疫15 d后采集心血分离血清。采用饱和硫酸铵沉淀及DEAE-52层析柱法分离并获得兔抗血清中IgG[14]。

1.6rColA胶原酶活性检测1 mL含100 μg rColA的CBB缓冲液(0.4 mmol/L CaCl2, 50 mmol/L Tris-HCl，pH7.4)中分别加入5 mg的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型天然胶原蛋白底物或Azocoll、Pz-肽化学合成底物(Sigma)，混匀后37 ℃孵育5 h，采用分光光度法分别检测OD570(Ⅰ～Ⅳ型天然胶原蛋白)、OD520(Azocoll)或OD320(Pz-肽)值，以确定rColA对各型胶原蛋白及Azocoll或Pz-肽的水解活性[15- 16]。

1.7Km值和Kcat值测定胶原酶活性检测结果显示，Ⅲ型胶原蛋白为rColA最适底物。1 mL含100 μg rColA的CBB缓冲液中分别加入0.25、0.5、1、2、3、4和5 mg Ⅲ型胶原蛋白，37 ℃孵育5 h后采用上述分光光度法检测rColA对不同浓度III型胶原蛋白的水解率，获得的数据用Lineweaver-Burk双倒数作图法计算rColA水解Ⅲ型胶原蛋白的酶动力学参数Km和Kcat值[17]。

1.8感染细胞后问号钩体总RNA制备问号钩体赖株培养物12 000 r/min离心15 min(15 ℃)，沉淀的问号钩体用无抗生素2% FCS dmem培养液重悬，Petroff-Hausser计数板(Fisher Scientific)计数[18]。按问号钩体：细胞=100∶1的感染指数(MOI)分别感染HUVEC、BEAS-2B、L-02、HEK293细胞1、2、4、8和12 h[19]。0.1%TritonX-100-TBS裂解细胞后，2 000 r/min 4 ℃离心5 min去除沉淀的细胞碎片，取上清12 000 r/min 4 ℃离心15 min沉淀问号钩体，采用TRIzol试剂(Life Technologies)提取总RNA，分光光度法测定其浓度和纯度[12,20]。

1.9实时荧光定量RT-PCR采用Primer Premier 6.0软件设计问号钩体赖株colA基因RT-PCR引物，上游引物：5′-CGC TCT TAA ACA GGT AGA ATC TCA AT-3′，下游引物：5′-GAA AAG GAT GAA AAG TTT CGT AAT CC-3′，产物长度134 bp。采用16S rRNA基因为内参照[21]，上游引物：5′-CTT TCG TGC CTC AGC GTC AGT-3′，下游引物：5′-CGC AGC CTG CAC TTG AAA CTA-3′，产物长度145 bp。荧光标记引物由上海Invitrogen公司合成。根据PrimeScript逆转录试剂盒(TaKaRa)说明书，将等量各钩体总RNA样本逆转录为cDNA，超纯水稀释5倍后作为PCR模板。采用SYBR Premix Ex-TaqTM荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa)及LightCycler 480实时荧光定量PCR仪(Roche)进行PCR。反应体系20 μL，内含0.2 μmol/L各引物和2 μL稀释逆转录产物模板。反应参数：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s，40个循环。获得的colA基因mRNA(colA-mRNA)实时荧光定量PCR数据用ΔΔCt相对定量法进行定量[20]。实验中用等量EMJH培养液中问号钩体为对照。

1.10ColA外分泌检测按上法用问号钩体赖株分别感染HUVEC、BEAS-2B、L-02、HEK293细胞1、2、4、8和12 h，0.05%NaTDC-PBS裂解细胞后12 000 r/min 4 ℃离心15 min，以去除沉淀的细胞及问号钩体，取上清用三氯乙酸沉淀法提取总蛋白[14]。以1∶200稀释兔抗rColA-IgG为一抗、HRP标记羊抗兔IgG(ImmunoResearch)为二抗，采用Western Blot检测总蛋白样本中ColA。实验中以问号钩体外分泌蛋白Sph2和胞浆蛋白FliY、等量问号钩体赖株EMJH培养物上清总蛋白为对照[14,22]。

2结果

2.1PCR结果及序列比较不同血清群的7株问号钩体均能扩增出全长colA基因片段(图1)，与GenBank中问号钩体colA基因序列(accession No.NC_004342)比较，所克隆的7个colA基因核苷酸和氨基酸序列相似性高达99.4%～100%。

M: DNA marker. Lane 1: blank control. Lanes 2 to 8: amplicons of colA gene from L. interrogans serovar Lai strain Lai, serovar Grippotyphosa strain Lin-6, serovar Autumnalis strain Lin-4, serovar Pomona strain Luo, serovar Hebdomadis strain P7, serovar Australis strain 65-9 and serovar Canicola strain Lin, respectively.

2.2rColA表达和提取效果在IPTG诱导下，E.coliBL21DE3pET42a-colA能有效表达目的重组蛋白rColA，Ni-NTA亲和层析法提取的rColA在分离胶中显示为单一的蛋白条带(图2)。

M: protein marker. 1: blank control(wild-type pET42a). 2 and 3: the expressed and purified rColA protein, respectively.

2.3rColA胶原酶活性问号钩体赖株rColA能不同程度地水解6种天然胶原蛋白或化学合成底物，但以水解III型胶原蛋白能力最强(P<0.05)(图3)，rColA水解III型胶原蛋白的Km和Kcat值分别为2.16 mg/mL和35.6 h-1(图4)。

*: P<0.05 vs the hydrolytic activity of rColA on type-I, type-II or type-IV collagen, and synthetic Azocoll or Pz-peptide substrate.

图4　rColA水解III型胶原蛋白的Km和Kcat值

2.4感染细胞时colA-mRNA水平显著上调问号钩体赖株感染HUVEC、BEAS-2B、L-02、HEK293细胞后，colA-mRNA水平迅速上调，感染4 h时达到峰值，明显高于EMJH培养基中问号钩体赖株colA-mRNA水平(P<0.01)(图5)。

*: P< 0.01 vs the colA-mRNA level in the spirochete incubated in the DMEM medium(0 h)

2.5感染细胞时问号钩体ColA外分泌问号钩体赖株EMJH培养物上清中未检出ColA，感染HUVEC、BEAS-2B、L-02、HEK293细胞后，共培养物上清中可检出ColA，且ColA水平随感染时间延长而逐渐升高(图6)。

图6　感染细胞时问号钩体赖株ColA外分泌

3讨论

毒力反映了病原微生物的致病能力，主要由侵袭力和毒素两部分组成。侵袭力是指病原微生物黏附与侵入宿主及细胞、宿主体内或胞内生存与繁殖及扩散的能力，其相关毒力因子主要有黏附素、荚膜和侵袭性酶类，其中胶原酶和透明质酸酶是原核细胞型病原微生物主要的侵袭性酶类[23]。如前所述，问号钩体能迅速侵入宿主、体内广泛播散并从感染宿主尿液排出，表明该病原微生物有极为强大的侵袭力[3-5]。因此，若能证明问号钩体colA基因产物具有胶原酶活性并在感染过程发挥作用，将有助于阐明问号钩体侵袭力的物质基础及其作用机制。

不同国家或地区流行的致病性钩体基因种存在差异，问号钩体是亚洲、欧洲、北美和南美主要流行的致病性钩体基因种，迄今从我国钩体病人分离的致病性钩体均为问号钩体[3,24]。尽管有15个问号钩体血清群及血清型代表株法定用于我国钩体病血清学诊断，但黄疸出血群赖型、流感伤寒群流感伤寒型、秋季群秋季型、波摩那群波摩那型、七日热群七日热型、澳洲群澳洲型、犬群犬型是我国人群感染的主要问号钩体血清群[25-26]。我们的实验结果显示，上述7个问号钩体血清群及血清型代表株均能扩增出全长colA基因片段，其核苷酸和氨基酸序列相似性高达99.4%以上，提示colA基因序列高度保守且广泛分布于我国主要问号钩体血清群中。

迄今我国发现问号钩体有18个血清群和75个血清型，但我国钩体病病人中约60%为问号钩体黄疸出血群感染所致[2,24]。此外，PCR及其产物测序结果已证实我国主要流行的问号钩体血清群colA基因序列高度保守[27]。因此，本研究中选择问号钩体黄疸出血群赖型赖株(国内编号56601)构建colA基因原核表达系统。实验结果显示，问号钩体赖株colA基因原核表达产物rColA能不同程度地水解I～IV型天然胶原蛋白以及化学合成的Azocoll、Pz-肽底物，但以水解III型胶原蛋白能力最强(P<0.05)，其水解III型胶原蛋白的Km和Kcat值分别为2.16 mg/mL和35.6 h-1。I型胶原蛋白主要分布于真皮层细胞胞外基质，II型胶原蛋白仅发现于软骨和玻璃体，IV型胶原蛋白为血管壁基底膜组分，III型胶原蛋白分布广泛，可见于真皮、血管壁以及肺、肝、肾、肠组织中[28]。因此，问号钩体colA基因产物不仅是胶原酶，且其较强的水解III型胶原蛋白能力对于问号钩体侵入宿主、经血流播散至内脏、尿液中排出等均具有重要意义。

如前所述，问号钩体感染过程中相继出现钩体血症、内脏播散和尿液排菌，故我们选择HUVEC脐静脉内皮细胞、BEAS-2B肺上皮细胞、L-02肝细胞和HEK293肾上皮细胞作为问号钩体黄疸出血群赖型赖株感染的宿主细胞。我们的实验结果显示，EMJH培养基中问号钩体赖株colA-mRNA水平较低，培养物上清中也未检出外分泌的ColA，但感染HUVEC、BEAS-2B、L-02、HEK293细胞后，不仅colA-mRNA水平迅速显著上调(P<0.01)，且问号钩体与细胞共培养物上清中可检出外分泌的ColA。与真核细胞不同，原核细胞仅在转录水平上调控靶基因表达，即mRNA水平可直接反映靶基因表达水平[12,20-22]。此外，问号钩体ColA作为侵袭性胶原酶，必须外分泌才能发挥其作用。因此，上述问号钩体感染细胞时colA基因表达上调并外分泌现象，提示该基因及其产物参与问号钩体致病过程并发挥实际作用。

参考文献：

[1]Bharti AR, Nally JE, Ricaldi JN, et al. Leptospirosis: A zoonotic disease of global importance[J].Lancet Infect Dis, 2003, 3(12): 757-771.

[2]Zhang CL, Wang H, Yan J. Leptospirosis prevalence in Chinese populations in the last two decades[J]. Microbes Infect, 2011, 14(4): 317-323. DOI: 10.1016/j.micinf.2011.11.007

[3]Yan J, Dai BM, Yu ES. Leptospirosis[M].3rd edition. Beijing: People’s Medical Publishing House, 2006.(in Chinese)

严杰，戴保民，于恩庶. 钩端螺旋体病学[M].3版，北京：人民卫生出版社，2006.

[4]Adler B, de la Pena Moctezuma A.Leptospiraand leptospirosis[J].Vet Microbiol, 2010, 140(3-4): 287-296. DOI: 10.1016/j.vetmic.2009.03.012

[5]McBride AJ, Athanazio DA, Reis MG, et al. Leptospirosis[J].Curr Opin Infect Dis, 2005, 18(5): 376-386.

[6]Awada MM, Ellemorb DM, Bryantc AE, et al. Construction and virulence testing of a collagenase mutant ofClostridiumperfringens[J].Microb Pathog, 2000, 28(2): 107-117.

[7]Matsushita O, Koide T, Kobayashi R, et al. Substrate recognition by the collagen-binding domain ofClostridiumhistolyticumclass I collagenase[J].J Biol Chem, 2001, 276(12): 8761-8770.

[8]Miyoshi SI, Nitanda Y, Fujii K, et al. Differential gene expression and extracellular secretion of the collagenolytic enzymes by the pathogenVibrioparahaemolyticus[J].FEMS Microbiol Lett, 2008, 283(2): 176-181. DOI: 10.1111/j.1574-6968.2008.01159.x

[9]Ren SX, Fu G, Jiang XG, et al. Unique physiological and pathogenic features ofLeptospirainterrogansrevealed by whole-genome sequencing[J].Nature, 2003, 422(6934): 888-893.

[10]Janwitthayanan W, Keelawat S, Payungporn S, et al.Invivogene expression and immunoreactivity ofLeptospiracollagenase[J].Microbiol Res, 2013, 168(5): 268-272. DOI: 10.1016/j.micres

[11]Lin XA, Sun AH, Ruan P, et al. Characterization of conserved combined T and B cell epitopes inLeptospirainterrogansmajor outer membrane proteins OmpL1 and LipL41[J].BMC Microbiol, 2011, 11(1): 21-26. DOI: 10.1186/1471-2180-11-21

[12]Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning, a latoratory manual[M].New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 1.21-1.52, 2.60-2.80, 7.30-7.35, 9.14-9.22.

[13]Vaganova AN, Stoianova NA, Tokarevich NK. Development of PCR test system based on colA gene for detection of leptospirae in clinical material[J].Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol, 2011, 5: 67-71.

[14]Wang H, Wu YF, Ojcius DM, et al. Leptospiral hemolysins induce proinflammatory cytokines through Toll-like receptor 2- and 4-mediated JNK and NF-κB signaling pathways[J].PLoS One, 2012, 7(8): e42266. DOI: 10.1371/journal.pone.0042266

[15]Jung CM, Matsushita O, Katayama S, et al. Identification of metal ligands in theClostridiumhistolyticumColH collagenase[J].J Bacteriol, 1999, 181(9): 2816-2822.

[16]Matsushita O, Yoshihara K, Katayama SI, et al. Purification and characterization of aClostridiumperfringens120-kilodalton collagenase and nucleotide sequence of the corresponding gene[J].J Bacteriol, 1994, 176(1): 149-156.

[17]Yu MS, Lee CY. Expression and characterization of the prtV gene encoding a collagenase fromVibrioparahaemolyticusinEscherichiacoli[J].Microbiology, 1999, 145(Pt 1): 143-150.

[18]Schreier S, Triampo W, Doungchawee G, et al. Leptospirosis research: fast, easy and reliable enumeration of mobile leptospires[J].Biol Res, 2009, 42(1): 5-12.

[19]Jin DD, Ojcius DM, Sun D, et al.Leptospirainterrogansinduces apoptosis in macrophages via caspase-8- and caspase-3-dependent pathways[J].Infect Immun, 2009, 77(2): 799-809. DOI: 10.1128/IAI.00914-08

[20]Zhang L, Zhang CL, Ojcius DM, et al. The mammalian cell entry(Mce) protein of pathogenicLeptospiraspecies is responsible for RGD motif-dependent infection of cells and animals[J].Mol Microbiol, 2012, 83(5): 1006-1023. DOI: 10.1111/j.1365-2958.2012.07985.x

[21]Zhao JF, Chen HH, Ojcius DM, et al. Identification ofLeptospirainterrogansphospholipase C as a novel virulence factor responsible for intracellular free calcium ion elevation during macrophage death[J].PLoS One, 2013, 8(10): e75652. DOI: 10.1371/journal.pone.0075652

[22]Liao SM, Sun AH, Ojcius DM, et al. Inactivation of thefliYgene encoding a flagellar motor switch protein attenuates mobility and virulence ofLeptospirainterrogansstrain Lai[J].BMC Microbiol, 2009, 9(12): 253-263. DOI: 10.1186/1471-2180-9-253

[23]Yan J. Medical microbiology[M].2nd edition. Beijing: Higher Education Press, 2012:47-48.(in Chinese)

严杰. 医学微生物学[M].2版.北京：高等教育出版社，2012:47-48.

[24]Hu WL, Lin XA, Yan J.Leptospiraand leptospirosis in China[J].Curr Opin Infect Dis, 2014, 27(5): 432-436. DOI: 10.1097/QCO.0000000000000097

[25]Luo DJ, Xue F, Ojcius DM, et al. Protein typing of major outer membrane lipoproteins from Chinese pathogenicLeptospiraspp. and characterization of their immunogenicity[J].Vaccine, 2010, 28(1): 243-255. DOI: 10.1016/j.vaccine.2009.09.089

[26]Dong HY, Hu Y, Xue F, et al. Characterization of theompL1 gene of pathogenicLeptospiraspeciesin China and cross-immunogenicity of the OmpL1 protein[J].BMC Microbiol, 2008, 8(12): e223. DOI: 10.1186/1471-2180-8-223

[27]Kassegne K, Hu W, Ojcius DM, et al. Identification of collagenase as a critical virulence factor for invasiveness and transmission of pathogenicLeptospiraspecies[J].J Infect Dis, 2014, 209(7): 1105-1115. DOI: 10.1093/infdis/jit659

[28]Heino J. The collagen family members as cell adhesion proteins[J].Bioessays, 2007, 29(10): 1001-1010.

DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.01.002

通讯作者：Kokouvi Kassegne，Email：med_bp@zju.edu.cn

中图分类号：R377.5

文献标识码：A

文章编号：1002-2694(2016)01-0007-06

Corresponding author:Kokouvi KASSEHNE, Email: med_bp@zju.edu.cn

收稿日期：2015-06-03；修回日期:2015-11-02

Collagenase activity and pathogenic mechanism of colA gene product of Leptospira interrogans

ZHAO Jin-fang1,TAN Pan-li1,WANG Zhe-jiong1,HU Wei-lin2, YAN Jie2,Kokouvi KASSEHNE2

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310006,China;2.DepartmentofMedicalMicrobiologyandParasitology,SchoolofMedicine,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China)

Abstract:To investigate the distribution and sequence conservation of colA gene in different serogroups of L. interrogans, as well as to determine the collagenase activity, expression and secretion of colA gene product of the spirochete during infection of host cells, PCR and its product sequencing were performed in seven L. interrogans serogroups that prevailing in China and the colA gene product of L. interrogans serogroup Icterohaemorrhagiae serovar Lai strain Lai was expressed by a prokaryotic expression system and extracted by Ni-NTA affinity chromatography. By using spectrophotometry, the ability of the recombinant protein(rColA) to hydrolyze I-IV type natural collagen proteins and two synthetic substrates(Azocoll and Pz-peptide) were determined, and the Km and Kcat values of rColA were also measured. Real-time fluorescent quantitative RT-PCR and Western Blot assay were applied to detect the colA-mRNA level change and ColA secretion of L. interrogans strain Lai during infection of HUVEC, BEAS-2B, L-02 or HEK293 cells. The results showed that the entire colA gene segments were amplified from the different L. interrogans serogroups with high nucleotide and amino acid sequence identities(99.4%-100%). The rColA could hydrolyze the six substrates in varying extents, in which the hydrolytic ability on type-III collagen showed to be the strongest(P<0.05), with 2.16 mg/mL Km and 35.6 h-1Kcat values. The colA-mRNA level of L. interrogans strain Lai was significantly increased(P<0.01) and the secreted ColA could be detectable in the supernatant of L. interrogans-cell co-cultures during infection of different host cells. These results indicated that the colA gene of L. interrogans is a sequence-conserved and extensively distributed collagenase-encoding gene. The up-regulated expression and external secretion of the gene product during infection of host cells imply its practical role in the process of L. interrogans infection.

Keywords:Leptospira interrogans; colA gene; collagenase; expression; secretion

国家自然科学基金(81261160321和81171534)；浙江省自然科学基金(LQ14H190001)