环孢素A对大鼠重症急性胰腺炎早期损伤和炎症反应的影响*

芦灵军　李天永　陈晓理　黄君　谢明均

(1.宜宾市第一人民医院，四川 宜宾 644000；2.四川大学华西医院普外科，四川 成都 610041)



环孢素A对大鼠重症急性胰腺炎早期损伤和炎症反应的影响*

芦灵军1李天永1陈晓理2黄君1谢明均1

(1.宜宾市第一人民医院，四川 宜宾 644000；2.四川大学华西医院普外科，四川 成都 610041)

【摘要】目的观察环孢素A对大鼠重症急性胰腺炎早期损伤和炎症反应的影响。方法将40只SD大鼠随机分为对照组(n=8)、重症急性胰腺炎组(n=16)和环孢素A组(n=16)。采用3.3%牛磺胆酸钠胆管注射法制备大鼠重症急性胰腺炎模型，环孢素A组在重症急性胰腺炎制模成功后40 min再经腹腔注射环孢素A (50mg/kg)。重症急性胰腺炎组和环孢素A组大鼠各分为6 h和24 h两个亚组，对照组大鼠于24 h时处死。抽取下腔静脉血测定血淀粉酶和C-反应蛋白，留取胰腺组织观察组织形态学变化并进行病理评分，通过免疫组化检测胰腺组织NF-κB p65 的表达。结果重症胰腺炎组血淀粉酶、C反应蛋白、胰腺病理评分和NF-κB p65 的表达均较对照组升高，并随时间延长而进一步升高(P<0.01)；同时间段环孢素A组与重症胰腺炎组相比，血淀粉酶、C反应蛋白、胰腺病理评分和NF-κBp65 的表达均降低(P<0.01)。NF-κBp65 的表达与胰腺病理评分正相关(r=0.982,P<0.01)。结论环孢素A可明显减轻大鼠重症急性胰腺炎早期胰腺损伤和炎症反应程度，其机制可能与抑制NF-κB 的表达有关。

【关键词】环孢素A；早期重症急性胰腺炎；实验研究；病理评分；免疫组化

急性胰腺炎是一种常见的急腹症。尽管在治疗上有一定进展，但重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)死亡率仍高达10%～30%[1]。炎性细胞和因子的过度活化在急性胰腺炎早期的发展中起重要作用，然而以细胞因子为基础的临床试验却令人失望[2]。炎症反应涉及许多因素和细胞，只针对某些因素或细胞可能无法终止整个活动过度的炎性反应，调节免疫炎性细胞的活性是一种新的尝试。先期的动物实验研究表明[3]，传统的免疫抑制剂环磷酰胺或甲氨蝶呤通过降低炎性细胞因子和抗炎细胞因子水平，使炎症反应维持在较低的活化状态，缓解SAP的疾病进展。本研究通过建立动物模型，观察新型免疫抑制剂环孢素A(cyclosporin A,CsA)对SAP的损伤和炎症反应的影响，为临床治疗提供新的理论依据和实验基础。

1材料与方法

1.1实验材料环孢素A注射液由瑞士诺华制药有限公司生产。牛磺胆酸钠(5g T0808)购自日本东京化成工业株式会社。大鼠C反应蛋白ELISA试剂盒购自上海凯博生化试剂有限公司。NF-κB p65大鼠单克隆抗体购自Abcam公司。健康6～7周龄雌性SD大鼠40只，体重180～250g，清洁级，由成都达硕动物实验有限公司提供。实验动物及实验使用条件符合国家科学技术委员会的《实验动物管理条例》。手术及实验操作主要在四川大学华西医院移植免疫实验室完成，胰淀粉酶以及C反应蛋白检测由成都中医药物评价中心检测完成，病理切片制作在四川大学华西医院病理研究室完成。

1.2实验方法

1.2.1动物分组与处理将健康雌性SD 大鼠40 只随机分为3 组：对照组(n=8)、SAP组(n=16)和CsA组(n=16)。大鼠术前12 h 禁食，自由饮水。对照组开腹后仅翻动胰腺；SAP组开腹后显露胰胆管，胰管穿刺针在乳头下端0.5cm处的无血管区穿刺针进入十二指肠，穿刺针顺利进入胰胆管后匀速注入3.3%牛磺胆酸钠2ml/kg，注射时间控制在60s左右；CsA组在重症胰腺炎制模成功后40 min再经腹腔注射环孢素A (50mg/kg)。SAP组和CsA组分别于术后6h和24h各处死8只大鼠，对照组大鼠于术后24h处死。予以3%戊巴比妥钠经腹腔注射麻醉，抽取下腔静脉血测定血淀粉酶和C-反应蛋白，处死大鼠后留取胰腺组织经10%的甲醛固定。

1.2.2指标检测①血淀粉酶用全自动生化分析仪检测。②C反应蛋白的测定采用ELISA 法按照试剂盒说明书进行。③胰腺组织病理形态学检测：胰腺组织常规石蜡包埋、HE染色后光学显微镜检查，每张切片观察5个高倍视野，按照schmidt标准[4]进行病理学评分。④Envision二步法检测胰腺组织NF-κB p65 的表达：按Envision试剂盒说明操作，切片常规脱蜡，微波修复抗原，过氧化氢避光封闭10min，将NF-κB抗体工作液滴加到组织切片上， 4℃孵育过夜，双蒸水洗3次换washbuffer，将HRP Rabbit/Mouse 检测二抗工作液滴加到组织切片上，37℃孵育40min，DAB显色，苏木素复染，中性快干树胶封片。每张切片随机观察5个高倍视野，以半定量积分法描述NF-κB p65染色情况[5]。染色强度按阴性染色、弱阳性染色、中度阳性染色、强阳性染色依次记0～3分，染色范围按阳性细胞占总细胞数比例<10%记0分，11%～25%记1分，26%～50%记2分，51%～75%记3分，>75%记4分，每张切片染色强度和染色范围所得分相加为最后得分。组织病理学和免疫组化指标检测由病理科医师盲法进行。

2结果

2.1血淀粉酶和C反应蛋白的变化各组大鼠之间血淀粉酶和C反应蛋白水平比较，差异有统计学意义(F=134.053，P<0.01；F=135.441，P<0.01)。SAP大鼠各时点的血淀粉酶和C反应蛋白水平较对照组上升(P<0.01)，并随时间的延长而进一步升高(P<0.01)；与同时间点的SAP组相比，CsA组大鼠血淀粉酶和C反应蛋白水平均降低，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1各组大鼠不同时间点血淀粉酶和C反应蛋白的比较

Table 1Comparison of blood amylase and C-reactive protein at different time points in different group of rats

组别n血淀粉酶(U/L)C反应蛋白(mg/L)对照组8889.33±87.170.13±0.02SAP组 6h83254.61±437.441.88±0.32 24h85106.98±581.252.24±0.23CsA组 6h82377.55±411.53①0.70±0.07① 24h84475.74±367.87①1.10±0.24①F134.053135.441P<0.01<0.01

注：CsA组与同时点SAP相比，①P<0.01

2.2各组大鼠胰腺组织病理学比较对照组大鼠胰腺小叶结构清晰，偶见少量炎细胞浸润。SAP-6h大鼠胰腺间质水肿较明显，血管充血，可见散在出血，部分胰腺上皮细胞变性、坏死伴较多炎细胞浸润；CsA-6h大鼠间质水肿减弱，出血不明显，胰腺上皮细胞变性、坏死区域减小，炎细胞浸润减少；SAP-24h大鼠胰腺间质广泛水肿，间质微血管破裂出血，胰腺坏死明显较广泛，部分腺泡结构紊乱，大量炎细胞浸润，以嗜中性粒细胞为主；CsA-24h大鼠间质水肿明显，间质微血管有破裂，胰腺变性坏死较明显，腺泡结构尚未破坏，炎细胞浸润仍比较明显，灶性区域可见淋巴细胞，见图1。

图1各组大鼠胰腺组织病理学改变的比较(10×10倍)

Figure 1Comparison of pathological changes of pancreas in different group of rats

对照组大鼠胰腺组织病理评分(0.38±0.44)，SAP-6h评分(7.69±0.88)，CsA-6h评分(6.31±0.70)，SAP-24h 评分(12.13±0.95)，CsA-24h评分(10.63±0.83)。各组之间病理评分比较，差异有统计学意义(F=270.550，P<0.01)。SAP大鼠各时点的病理评分较对照组上升(P<0.01)，并随时间的延长而进一步升高(P<0.01)；CsA组较同时点的SAP组大鼠病理评分降低，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.3各组大鼠胰腺NF-κB p65的表达情况对照组大鼠胰腺中NF-κB p65基本无阳性表达，SAP-6h 时NF-κB p65的表达主要位于胰腺腺泡的胞浆，呈浅黄色或黄色，阳性细胞率约25%～50%；SAP-24h 时NF-κB p65的表达主要位于胰腺腺泡的胞浆和胞核，呈黄色或棕黄色，阳性细胞率在50%以上；CsA组大鼠NF-κB p65的表达与SAP组对应时点相比免疫阳性细胞减少，着色减弱，见图2。

图2各组大鼠胰腺组织NF-κB p65表达的比较

Figure 2Comparison of NF-κB p65 expression of pancreas in different group of rats

对照组大鼠NF-κB p65免疫组化评分(0.25±0.46)，SAP-6h评分(3.88±0.83)，CsA-6h评分(2.88±0.64)，SAP-24h 评分(5.88±0.64)，CsA-24h评分(4.25±0.71)。各组之间评分比较，差异有统计学意义(F=77.364，P<0.01)。SAP大鼠各时点的免疫组化评分较对照组上升(P<0.01)，并随时间的延长而进一步升高(P<0.01)；CsA组免疫组化评分较同时点的SAP组降低，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

2.4相关性分析结果血淀粉酶与病理评分呈正相关(r=0.987，P=0.002)，NF-κB p65表达与病理评分呈正相关(r=0.982，P=0.003)，C反应蛋白水平与病理评分不相关(P=0.090)。

表2各组大鼠不同时间点组织病理学评分和免疫组化评分的比较

Table.1Comparison of histopathological grading and immunohistochemical score at different time points in different group of rats

组别n组织病理学评分免疫组化评分对照组80.38±0.440.25±0.46SAP组 6h87.69±0.883.88±0.83 24h812.13±0.955.88±0.64CsA组 6h86.31±0.70①2.88±0.64① 24h810.63±0.83①4.25±0.71①F270.55077.364P<0.01<0.01

注：CsA组与同时间点SAP相比，①P<0.01

3讨论

急性胰腺炎是多种因素导致胰酶激活引起胰腺组织自身消化而水肿、出血甚至坏死的炎性反应。近期来的研究表明，免疫功能紊乱在SAP发病机制中的作用受到广泛关注，免疫炎性细胞及其因子和介质的协同作用在急性胰腺炎导致的全身性炎症中起重要作用。在SAP初始阶段，胰蛋白酶激活，腺泡细胞破坏引起胰腺自身消化，造成胰腺局部的炎症反应。早期过度的炎性细胞及其释放的大量介质，激发难以控制的炎症级联反应，引起机体过强的炎症免疫反应，促使炎症扩散，造成重要脏器继发性损伤，导致全身炎性反应综合征、多器官功能障碍乃至死亡[6-8]。

SAP早期以免疫过激为主，传统的免疫抑制治疗可以减轻炎症反应，减轻对机体的损伤。在临床上5-氟尿嘧啶可用于治疗急性胰腺炎，最早认为其作用机理是抑制胰蛋白酶的分泌。而此后的实验研究发现，5-氟尿嘧啶、糖皮质激素、环磷酰胺、甲氨蝶呤等免疫抑制药物可以同时降低SAP的炎性细胞因子和抗炎细胞因子水平，适度降低早期过高的免疫过激，降低胰淀粉酶水平和胰腺湿重，缓解疾病进展。本研究建立SAP模型后用环孢素A进行干预，检测不同时点大鼠血淀粉酶和C反应蛋白水平，胰腺病理评分评价组织损伤程度，探讨新型T淋巴细胞功能调节剂环孢素A在SAP早期损伤和炎症反应过程中的作用。血淀粉酶是临床诊断急性胰腺炎的常用指标，在一定程度上反映病情的严重程度。C反应蛋白作为肝脏合成的急性时相蛋白，直接参与了炎症过程，是一个有价值的预后评价指标，可早期评估急性胰腺炎的严重程度[9-12]。胰腺病理评分从水肿、出血、坏死及炎症细胞浸润等4个方面综合评价胰腺的损伤程度。本研究结果显示SAP大鼠在6h时点血淀粉酶和C反应蛋白水平就明显升高，组织病理学上有较为明显的胰腺损伤表现，24h时点血淀粉酶和C反应蛋白水平进一步升高，组织病理学上胰腺损伤表现也更加突出，胰腺炎的损伤程度随时间延长而进一步加重。相同时点的CsA组与SAP组相比，无论是血淀粉酶和C反应蛋白水平，还是组织病理学评分，都有显著性改善，表明环孢素A可以减轻SAP早期大鼠胰腺损伤和炎症反应程度，缓解疾病进展。

NF-κB是一种广泛存在于真核细胞内的核转录因子，起初是从B淋巴细胞核中提取，主要参与调节胚胎发育、机体炎症、组织损伤和修复等相关的基因表达[13-14]。近年来NF-κB在急性胰腺炎发病机制中的作用越来越受到重视。发病初期，局部炎症可通过NF-κB介导多种炎性细胞因子激活，触发炎症介质“瀑布样级联反应”，使急性胰腺炎从局部病变发展为全身炎症反应综合征和多器官功能衰竭[15-16]。NF-κB作为主要参与炎性分子表达调控的核转录因子，通常以二聚体形式存在，并与胞质内的抑制因子(I-κB)蛋白结合。当受到炎性刺激时以活化状态向核内转移，调控炎症相关基因的转录和表达。有证据表明[17-18]，急性胰腺炎早期NF-κB的活化与细胞内胰蛋白酶原激活同时发生，是两大独立的早期事件。胰蛋白酶原激活造成早期腺泡细胞损伤，但急性胰腺炎早期强烈的炎症反应是由NF-κB活化来诱导的[19-20]，NF-κB在诱导和控制免疫炎症反应中细胞因子的基因表达中起关键作用[21]。本研究结果显示SAP大鼠在6h时点胰腺腺泡的胞浆中NF-κB p65就有表达，呈浅黄色或黄色，24h时点胞浆和胞核都有表达，阳性细胞数增加，染色加深，说明急性胰腺炎的病情严重程度与NF-κB的表达密切相关；对应时点CsA组大鼠NF-κB p65的表达与SAP组相比免疫阳性细胞减少，免疫组化评分下降，表明环孢素A可以通过减轻NF-κB 的过度活化，减少其介导的多种炎性细胞因子激活，减轻大鼠胰腺损伤和炎症反应程度。NF-κB p65 的表达与胰腺病理评分相关性分析显示两者之间存在正相关，表明环孢素A对SAP早期的保护作用与减轻NF-κB 的过度活化有关。

4结论

环孢素A作为钙调磷酸酶抑制剂类药物，主要通过特异性地抑制辅助性T淋巴细胞的活性发挥免疫抑制作用。在SAP早期过激的免疫炎症反应加重了胰腺的损伤，而早期应用环孢素A干预后血清淀粉酶和C反应蛋白降低，可使胰腺病理评分得以改善，本文研究结果表明环孢素A能明显减轻大鼠重症急性胰腺炎早期胰腺损伤和炎症反应程度，其机制可能与抑制NF-κB 的表达有关。

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基金项目：四川省卫生厅科研课题(100589)

通讯作者：陈晓理，Email:zean_z@yahoo.com.cn

【中图分类号】R 657.5+1

【文献标志码】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.07.006

(收稿日期：2015-12-01；编辑：陈舟贵)

Effect of cyclosporine A on injury and inflammation in rats with early severe acute pancreatitis

LU Lingjun1,CHEN Xiaoli2,LI Tianyong1,et al

(1.Department of General Surgery,The First People’s Hospital of Yibin,Yibin 644000,Sichuan,China;2.Department of General Surgery,West China Hospital,Sichuan University,Chengdu 610041,China)

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect of cyclosporine A on injury and inflammation in rats with early severe acute pancreatitis.Methods40 rats were divided randomly into the control group (n=8),severe acute pancreatitis (SAP) group (n=16) and Cyclosporine A (CsA) group (n=16).The rat of SAP group was induced by bile duct injection with 3.3% taurocholic acid.In the CsA group,50 mg/kg of CsA was injected intraperitonealy 40 minutes after SAP was induced.SAP group and CsA group were divided into 6 h and 24 h subgroup respectively,and the rat of control group was sacrificed 24 hours after operation.Serum amylase and C- reactive protein were measured by extracting the inferior vena venous blood,morphological changes and pathological score of pancreatic were observed,and the expression of NF-κB p65 in pancreatic tissue was detected by immunohistochemistry.ResultsSerum amylase,C- reactive protein,pathological score and expression of NF-κB p65 in SAP group increased compared with the control group,and further increased with time(P<0.01).Compared with that of the SAP group on the same time point,serum amylase,C- reactive protein,pathological score and expression of NF-κB p65 decreased significantly(P<0.01).The expression of NF-κB p65 was positively correlated to pancreatic pathological score(r=0.982,P<0.01).ConclusionCyclosporine A can relieve the pancreatic injury and inflammation in rats with early severe acute pancreatitis,and the mechanism may be relate to inhibiting the expression of NF-κB.

【Key words】Cyclosporine A; Early severe acute panccretitis; Experimental research; Pathological score; Immunohistochemistry