鸡组织中磺胺对甲氧嘧啶和二甲氧苄啶残留的HPLC-MS/MS测定

徐　维，曾振灵，权　丹，周雨卉，王　佩，王嘉鹏，韩可可，陈　红

(华南农业大学兽医学院国家兽药残留基准实验室，广东广州 510642)



鸡组织中磺胺对甲氧嘧啶和二甲氧苄啶残留的HPLC-MS/MS测定

徐维，曾振灵，权丹，周雨卉，王佩，王嘉鹏，韩可可，陈红*

(华南农业大学兽医学院国家兽药残留基准实验室，广东广州 510642)

摘要：建立了同时测定鸡组织中残留的磺胺对甲氧嘧啶(SMD)和二甲氧苄啶(DVD)了的高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)。样品经乙腈提取，取部分提取液用正己烷脱脂后于氮气吹干，残渣用流动相溶解并定容后上机检测，外标法定量。采用C18色谱柱，流动相为乙腈和1 mL/L甲酸水溶液。选择1个母离子和2个子离子进行反应监测，对磺胺对甲氧嘧啶和二甲氧苄啶残留进行定性，选择信号最强的子离子进行定量。结果显示，SMD和DVD分别在1 ng/mL～200 ng/mL和0.5 ng/mL～100 ng/mL范围内呈良好线性关系，相关系数R2>0.992。通过空白样品添加回收试验，所有基质中SMD和DVD的定量限分别为10 μg/kg和5 μg/kg，SMD和DVD分别在50、100、200 μg/kg和25、50、100 μg/kg 3个添加水平下的回收率为71.7%～115.0%，相对标准偏差为1.8%～13.2%，该方法定量限低，灵敏度高，重现性好，符合相关研究的要求。

关键词：液相色谱-串联质谱；磺胺对甲氧嘧啶；二甲氧苄啶；残留；鸡

磺胺对甲氧嘧啶(sulfametoxydiazine，SMD)是磺胺类药物的一种，其抗菌范围广、副作用小，乙酰化率低，且溶解度高，兽医临床上SMD常用于敏感菌所致的泌尿生殖道感染、呼吸道感染、消化道感染和皮肤软组织感染及饲料添加剂[1]。二甲氧苄啶(diaveridine,DVD)属于磺胺增效剂的一种，抗菌谱较广，对多种革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抗菌作用。二甲氧苄啶与磺胺对甲氧嘧啶混合制成预混剂可用于治疗家禽细菌感染，对球虫病和畜禽肠道感染也有良好的防治作用[2]。但这2种药物都有一定的毒性且在实际生产中过量使用会导致在食用动物产品中大量残留，给人类健康带来潜在的威胁。国际食品法典委员会(CAC)和很多国家都规定，食品中磺胺类药物总量及单个药物的最大残留限量(MRL)为100 μg/kg[3]。目前关于磺胺类药及其增效剂的报道有很多，但大部分是采用多残留方法[4-6]，前处理方法繁琐，而且不适用于鸡组织样品中的检测。本试验旨在建立一种适用于鸡组织中同时测定磺胺对甲氧嘧啶和二甲氧苄啶残留量的简便前处理方法。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1试验用动物供试鸡为白羽肉鸡，购自华南农业大学增城正大肉鸡发展中心，35日龄，体重在2.0 kg～2.5 kg之间，笼养，自由饮水、采食不含抗菌药物的全价饲料。

1.1.2仪器设备液相质谱仪(Agilent6430型串联三重四级杆质谱)，美国Agilent公司产品；Agilent1200液相色谱仪、可调微量移液器，法国Gilson公司产品；超纯水器，美国Milli2Q公司产品；台式高速离心机(Centrifuge5804)，Eppendorf公司产品；FJ-200漩涡混悬器，上海沪西分析仪器厂生产；电子分析天平(日本/岛津AUW120D型)。

1.1.3药品与主要试剂乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯，Merck公司产品；正己烷(分析纯)，国产；磺胺对甲氧嘧啶标准品(含量99.0%)，购于Dr．Ehrenstorfer GmbH。

磺胺对甲氧嘧啶贮备液(1 mg/mL)：准确称取10.10 mg磺胺对甲氧嘧啶对照品于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配成浓度为1 mg/mL的标准储备液，于-20℃条件下贮存，根据需要再用乙腈稀释成适当浓度的标准工作液。

二甲氧苄啶(含量100%)，购于中国药品生物制品检定所。

二甲氧苄啶贮备液(1 mg/mL)：准确称取10.00 mg二甲氧苄啶对照品于10 mL棕色容量瓶中，少量0.1 mol/L盐酸溶解后用乙腈定容，配成浓度为1 mg/mL的标准储备液，置-20℃条件下贮存，根据需要再用乙腈稀释成适当浓度的标准工作液。

1.2方法

1.2.1样品的制备样品的制备包括取绞碎后的供试样品，作为供试试料；取绞碎后的空白样品，作为空白试料；取绞碎后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。

1.2.2提取准确称取1.00 g±0.02 g样品(鸡肉、皮脂、肝和肾)于50 mL离心管中，加入5 mL乙腈，涡旋1 min，超声10 min，于水平振荡器300 mot/min振荡20 min，8 000 r/min离心10 min，将乙腈层转移至15 mL离心管中。再用4 mL乙腈重复提取残渣1次，合并提取液，用乙腈定容至10 mL。准确移取1 mL提取液用1 mL乙腈饱和正己烷除脂两次，弃去正己烷层，于35℃水浴中氮吹浓缩至干后，用1 mL 1 mL/L甲酸水与乙腈(95∶5)混合溶液溶解残渣，涡旋混匀，15 000 r/min离心10 min，样品过0.22 μm滤膜后移入棕色进样瓶中，供HPLC-MS/MS分析。

1.2.3液相色谱条件色谱柱：C18柱(150 mm×2 mm，5 μm，Phenomenex)；流速：0.25 mL/min。

进样体积：5 μL；流动相：溶液A：1 mL/L甲酸水；溶液B：色谱乙腈。采用梯度洗脱，流动相梯度洗脱条件见表1。

表1　流动相梯度洗脱条件

1.2.4质谱条件电喷雾离子化源，正离子扫描(Positive)；检测方式：多反应监测(MRM)；干燥气：N2；干燥气温度：350℃；正模式毛细管电压：3 500 V；磺胺对甲氧嘧啶和二甲氧苄啶的质谱碎片信息见表2。

表2　2种药物的母离子与选择离子碎片

注：下划线的离子代表定量离子。

Note：Underlined ions were used to quantify.

1.2.5标准曲线及线性范围为消除样品基质效应，采用空白基质匹配标准溶液法制得各个组织相应的标准曲线：准确称取1.00 g±0.02 g空白组织于50 mL离心管中，按照1.2.2所示方法处理样品，用各组织的空白提取液分别稀释SMD、DVD的储备液，分别使SMD的线性范围为1 ng/mL～200 ng/mL、DVD的线性范围为0.5 ng/mL～100 ng/mL，并按1.2.3和1.2.4液质条件进行测定。每个浓度样品测定3次，连续测定3批，将测得的SMD和DVD的色谱峰面积(y)与相对应的药物浓度(x)作直线回归，求得标准曲线方程和相关系数。1.2.6定量限(LOQ)和检测限(LOD)准确称取空白组织1.00 g±0.02 g，依次加入100 μL SMD和DVD不同质量浓度的混合标准工作液，涡旋混匀，使得样品中SMD和DVD的浓度分别为2、3、4、5、10 μg/kg，每个浓度做5个平行，按照1.2.2方法处理样品，按1.2.3和1.2.4液质条件进行分析检测。以信噪比(S/N)≥3确定方法检测限，以(S/N)≥10确定方法定量限。

1.2.7回收率及变异系数空白组织制成匀浆后，将一定量的SMD和DVD的混合标准工作液加入到1.00 g±0.02 g组织中，制得1/2MRL、MRL、2MRL 3个添加水平样品，涡旋混匀，静置30 min，按组织样品提取净化方法处理并进行HPLC-MS/MS测定。每个浓度做5个平行，共做3个批次，以样品药物峰面积与相应浓度标准工作液的峰面积进行比较，求得高、中、低3种浓度下该方法的提取回收率，并计算批间和批内变异系数。

2　结果

2.1色谱

本研究结果表明，在此条件下，磺胺对甲氧嘧啶和二甲氧苄啶均能达到基线分离，峰形尖锐、对称性好。所得鸡空白组织、标准溶液、空白组织添加色谱图见图1、图2和图3。DVD及SMD的保留时间分别在7.6 min及8.2 min左右。

2.2标准曲线及线性范围

空白组织中添加不同浓度的磺胺对甲氧嘧啶、二甲氧苄啶标准工作液后所得的标准曲线的回归方程及相关系数见表3和表4。

图1　空白组织色谱图

图2　5 ng/mL DVD (7.680 min)和10 ng/mL SMD (8.274 min)标准溶液色谱图

图3　空白组织添加DVD ( 100 μg/kg ) 和SMD(200 μg/kg)色谱图

组织Tissues批次Batches线性范围/(ng·g-1)Linearranges回归方程Linearequations相关系数Correlationcoefficients110～2000y=204.87x+166.260.9964肌肉Muscle210～2000y=185.17x+282.600.9970310～2000y=163.62x+275.400.9992110～2000y=150.29x+125.540.9980皮脂Skin+fat210～2000y=144.96x+146.560.9987310～2000y=116.63x+134.180.9996110～2000y=173.78x+107.400.9988肝脏Liver210～2000y=176.23x+126.830.9955310～2000y=159.10x+103.640.9948110～2000y=199.18x+235.600.9920肾脏Kidney210～2000y=181.11x+138.530.9938310～2000y=157.21x+119.710.9992

表4　鸡组织中二甲氧苄啶的标准曲线

2.3定量限(LOQ)和检测限(LOD)

按1.2.2方法处理样品，得到各组织中磺胺对甲氧嘧啶的检测限(LOD)为2 μg/kg，定量限(LOQ)为10 μg/kg；二甲氧苄啶的检测限为2 μg/kg，定量限为5 μg/kg。

2.4回收率及变异系数

各空白组织中添加不同浓度的磺胺对甲氧嘧啶和二甲氧苄啶的混合标准液后的回收率及变异系数结果见表5和表6。

从表5和表6可以看出，在鸡组织中磺胺对甲氧嘧啶添加浓度为50、100、200 μg/kg 时，回收率在74.2%～115.0%范围内，批内变异系数CV<12%，批间变异系数CV<14%；二甲氧苄啶在鸡组织样品中添加浓度为25、50、100 μg/kg 时，回收率在71.7%～104.4%范围内，批内变异系数CV<11%，批间变异系数CV<14%；方法的准确度和精密度均符合残留分析的要求。

表5　二甲氧苄啶在鸡组织中的添加回收率和变异系数

表6　磺胺对甲氧嘧啶在鸡组织中的添加回收率和变异系数

3　讨论

3.1提取剂的选择

磺胺类药物难溶于水，较易溶于稀酸、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷和三氯甲烷等有机溶剂[7]。二甲氧苄啶结构式中含有氨基，具有弱碱性，在提取剂选择方面，林海丹等用碱性二氯甲烷对组织中的敌菌净(二甲氧苄啶)进行提取[2]。本试验选用乙腈、乙酸乙酯、乙酸乙腈、碱性乙腈、碱性乙酸乙酯为提取剂，结果发现，乙腈对SMD的提取效率最好，碱性乙腈次之，乙酸乙酯及碱性乙酸乙酯提取液脂肪含量较高，不利于净化处理，提取效率较低；但乙酸乙酯对二甲氧苄啶的提取效率高于乙腈。由于SMD为极性化合物易溶于极性有机试剂，而乙酸乙酯属于中等极性且沉淀蛋白效果不如乙腈，因此，为了同时测定SMD和DVD，本研究采用乙腈提取的方法进行，提取液经乙腈饱和正己烷脱脂净化，可以脱去脂肪，减少杂质的干扰，操作简单。

3.2检测方法的选择

磺胺类药物和二甲氧苄啶在250 nm～290 nm波长区间有强的紫外吸收，因此HPLC的在线检测，一般采用紫外检测[8]。陈丽等[9]用配有紫外检测器的高效液相色谱仪测定动物源食品中二甲氧苄啶的残留量，目标物能与干扰物质完全分离。我们在研究中采用紫外检测法分析后，发现二甲氧苄啶色谱峰与干扰峰重叠，无法定量和定性，磺胺对甲氧嘧啶色谱峰附近干扰峰多，定性准确性低。通过改变液相条件、提取溶剂、净化处理都无法达到分离的目的，而质谱检测法，干扰峰少、药物峰响应值高，定性和定量的准确性都有明显的优势且能够达到同时测定磺胺对甲氧嘧啶与二甲氧苄啶的目的。因此，笔者采用液相色谱串联质谱法进行检测。

3.3色谱分离条件的选择

磺胺类药物和二甲氧苄啶结构式中均含有多个胺基团，具有一定的弱碱性。因此，调节流动相中的pH，可以抑制弱碱的离解，从而导致保留时间的改变[10]。为了达到SMD和DVD与杂质的有效分离和缩短样品的分析时间，本研究采用乙腈1 mL/L甲酸水混合溶液作为流动相，进行梯度洗脱。本研究结果表明，在此条件下，磺胺对甲氧嘧啶和二甲氧苄啶均能达到基线分离，峰形尖锐、对称性好。所得鸡空白组织、标准溶液、空白组织添加色谱图见图1、图2和图3。DVD及SMD的保留时间分别在7.6 min及8.2 min左右。

由于磺胺类药物具有性质稳定、使用方便、抗菌谱广，国内能大量生产等优点，特别是磺胺药与甲氧苄啶和二甲氧苄啶等抗菌增效剂的联合使用后，抗菌活性大大增强，可以从抑菌作用变为杀菌作用[11]。因此，磺胺类药物目前仍然是养殖场经常使用的抗菌药物之一。然而药物的使用不当造成其在动物组织中富集，可直接或间接地通过环境和食物链的作用对人体产生一定的毒副作用，引起细菌耐药性的增加[12]。当药物在人体内蓄积超过一定浓度时，将对人体机能产生损害，磺胺类药物的副反应有过敏反应、尿结晶和造血紊乱等。因此，磺胺类药物的残留及其带来的食品安全问题已引起人们的广泛关注[13]。目前，在国内关于磺胺类多残留检测方法的报道有很多，袁中珍等[14]报道了免疫亲和柱净化/高效液相色谱法同时测定动物源性食品中16 种磺胺类药物残留，该方法简便快速、灵敏度高、溶剂用量少且环保，适用于动物源性食品中磺胺类药物残留的测定。刘振伟等[15]研究了固相萃取-高效液相色谱法测定动物组织中甲氧苄氨嘧啶及磺胺类药物残留，该方法适用于动物组织中甲氧苄氨嘧啶和5种磺胺药的同时测定。王静等[16]报道了ASE-GPC-HPLC法同时测定水产品中13种磺胺类和甲氧苄啶的残留，该方法运用ASE的提取优势和GPC的净化效果提高了检测结果的回收率和精密度，降低基质干扰。在国外有Kishida K等[17]报道鸡血浆、组织和鸡蛋中磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲氧哒嗪及其代谢物同时测定的液相色谱法和Berzas Nevado J J等[18]研究液相色谱法同时测定磺胺喹噁啉、磺胺二甲嘧啶及乙胺嘧啶。但在国内外尚未发现同时测定鸡组织中磺胺对甲氧嘧啶和二甲氧苄啶残留量的报道，本文建立了高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS-MS)同时测定鸡组织中磺胺对甲氧嘧啶和二甲氧苄啶的残留，通过优化质谱条件和色谱条件，使这两种药能够很好的分离，有效缩短了分析周期。该方法无需使用SPE小柱，净化简单，操作方便，是一种快速、灵敏、实用的方法，适用于鸡组织中磺胺类药物及其抗菌增效剂残留的同时检测。该方法的建立为监控动物源性食品中磺胺类药物及其增效剂的残留提供了技术支持，并为磺胺类药物的进一步研究提供帮助。

参考文献：

[1]方钲.磺胺对甲氧嘧啶胶体金免疫层析[D].江苏扬州:扬州大学,2010.

[2]元波,郭红燕,高又文,等.猪粪便和尿液中二甲氧苄啶的液相色谱串联质谱检测方法研究[J].广东农业科学,2013(17):101-103.

[3]吴海燕,郭萌萌,谭志军,等.磺胺类药物残留稳定性研究及检测方法的比较[J].中国农学通报,2014(5):53-60.

[4]Koesukwiwat,Jayanta U,Leepipatpiboon S,et al.Validation of a liquid chromatography-mass spectrometry multi-residue method for the simultaneous determination of sulfonamides,tetracyclines,and pyrimethamine in milk[J].J Chromatogr A,2007,1140(1-2):147-156.

[5]Kishida K F N.Matrix solid-phase dispersion extraction and high-performance liquid chromatographic determination of residual sulfonamides in chicken[J].J Chromatogr A,2001,937(1):49 - 55.

[6]倪永付,朱涛,闫秋成,等.高效液相色谱—串联质谱法测定羊肉中6种磺胺类药物残留[J].农产品加工,2011(8):90-92.

[7]陈坤才,刘莉治,彭荣飞,等.电喷雾超高效液质联用法测定动物性食品中磺胺类药残[J].中国卫生检验杂志,2012(9):2034-2036.

[8]冯学忠,黎华鹏,盘苑芷,等.HPLC同时测定复方二甲硝咪唑可溶性粉中地美硝唑、甲氧苄啶、磺胺对甲氧嘧啶的含量[J].动物医学进展,2011,32(7):55-60.

[9]陈丽,杨长志,刘永,等.高效液相色谱法测定动物源性食品中敌菌净残留量[J].化学工程师,2008(12):50-53.

[10]蒋原,沈崇钰,姚义刚,等.动物源性食品中磺胺类药物增效剂残留的高效液相色谱-串联质谱法测定[J].分析测试学报,2009(7):834-837.

[11]刘开成,郑增忍,单虎,等.不同地区猪源大肠埃希菌磺胺类药物耐药性研究[J].动物医学进展,2011(4):76-79.

[12]黄华,陈君慧,冯楠,等.动物源性食品中磺胺类药物残留前处理和检测方法研究进展[J].食品工业科技,2013(4):378-381.

[13]韩冰,杨洪波,王荻,等.复方磺胺甲噁唑在鲫组织中高效液相色谱检测法的建立与残留消除规律[J].食品安全质量检测学报,2014(2):401-407.

[14]袁中珍,张雷,唐柏彬,等.免疫亲和柱净化/高效液相色谱法同时测定动物源性食品中16种磺胺类药物残留[J].分析测试学报,2013(4):478-482.

[15]刘振伟,姜兆兴,曹旭,等.固相萃取-高效液相色谱法测定动物组织织中甲氧苄氨嘧啶及磺胺类药物残留[J].中国动物检疫,2010,27(05):36-38.

[16]沈吴淇,张美琴,王静,等.ASE-GPC-HPLC法同时测定水产平品中13种磺胺类和甲氧苄啶的残留[J].水产学报,2013,37(8):1244-1246.

[17]Kishida K,Furusawa N.Simultaneous determination of sulfamonomethoxine,sulfadimethoxine,and their hydroxy/-acetyl metabolites with gradient liquid chromatography in chicken plasma,tissues,and eggs[J].Talanta,2005,67(1):54-58.

[18]Berzas Nevado J J,Castaneda Penalvo G,Guzman Bernardo F J,et al.Simultaneous determination of sulfaquinoxaline,sulfamethazine and pyrimethamine by liquid chromatography[J].J Chromatogr A,2000,870:169-177.

收稿日期：2015-04-27

基金项目：农业部兽药行业标准制定和修订项目[农财发(2013)46号-32]

作者简介：徐维(1990-)，女，江西宜春人，硕士，主要从事基础兽医药理与毒理学研究。*通讯作者

中图分类号:S859.796

文献标识码:A

文章编号:1007-5038(2016)07-0057-07

Simultaneous Determination of Sulfametoxydiazine and Diaveridine Residues in Chicken Tissues by High Performance Liquid Chromatographic Tandem Mass Spectrometry

XU Wei,ZENG Zhen-ling,QUAN Dan,ZHOU Yu-hui,WANG Pei,WANG Jia-peng,HAN Ke-ke,CHEN Hong

(NationalReferenceLaboratoryofVeterinaryResidues,CollegeofVeterinaryMedicine,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,Guangdong,510642,China)

Abstract:A high performance liquid chromatographic tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method was presented for simultaneous determination of sulfametoxydiazine and diaveridine residues in chicken.The samples were extracted with acetonitrile,then part of the extracts were cleaned up by n-hexane，followed by blowing to dryness under nitrogen gas stream,reconstitution with mobile phase before the analysis on HPLC-MS/MS using external standard method.The separation of analytes was performed on C18 analytical chromatographic column with a gradient elution using acetonitrile (A) and 1 mL/L formic acid (B) solution as mobile phase.The analysis of sulfametoxydiazine and diaveridine was performed under selective reaction monitoring(SRM) mode by selecting one parent ion and two daughter ions as qualitative ions,and the most abundant daughter ion as a quantitative ion.The calibration curves of SMD and DVD were linear in the concentration range of 1 ng/mL-200 ng/mL and 0.5 ng/mL-100 ng/mL respectively,with correlation coefficients more than 0.992.The quantitative limits of the method for SMD and DVD were 10 μg/kg and 5 μg/kg respectively for all matrices,and the recoveries were in the range of 71.7%-115.0% with RSDs of 1.8%-13.2% while blank samples were spiked with sulfametoxydiazine and diaveridine at 50，100，200 μg/kg and 25，50，100 μg/kg,respectively.This analytical method meets the requirements for assays.

Key words:HPLC-MS/MS; sulfametoxydiazine; diaveridine; residue；chicken tissue